由大肠杆菌产生的修饰的三角酵母D-氨基酸氧化酶制备头孢菌素烷基7β-(4-羧丁基酰胺)酸的方法技术

酶法制备头孢菌素烷基７β－（４－羧丁基酰胺）酸，是通过在大肠杆菌中产生的修饰过了的三角酵母（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）Ｄ－氨基酸氧化酶进行的，该方法包含：（１）分离相应于编码Ｄ－氨基酸氧化酶基因的ＤＮＡ；（２）去除所述的基因中的内含子；（３）将得到的ＤＮＡ片段插入在大肠杆菌中能够复制的质粒；（４）合成含有编码６个组氨酸的一段核苷酸序列，融合到基因结构区的５’端；（５）用所得的重组质粒转化大肠杆菌；（６）培养转化了的大肠杆菌细胞；和（７）通过亲和层析回收前面培养细胞的Ｄ－氨基酸氧化酶。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种在非人寄主的生物体中生产修饰的三角酵母（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）Ｄ－氨基酸氧化酶的方法，其特征包含如下步骤：（ａ）分离产生所述的Ｄ－氨基酸氧化酶的任何一种微生物的编码所述酶的基因的ＤＮＡ；（ｂ）通过用合成的 寡核苷酸和聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，去除所述的基因所含的内含子；（ｃ）将（ｂ）所得到的寡核苷酸ＤＮＡ片段插入能够在宿主中复制的质粒中；（ｄ）将一种合成的含有编码六个组氨酸的核苷酸序列融合于编码Ｄ－氨基酸氧化酶活性的结构基因区的５ ’端，该基因不含任何内含子；（ｅ）用由（ｄ）产生的重组质粒转化宿主；（ｆ）用适当的培养基，在得以Ｄ－氨基酸氧化酶产生的条件下，培养由（ｅ）得到的转化了的宿主细胞；（ｇ）由（ｆ）的培养物中通过亲和层析回收Ｄ－氨基酸氧化酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：何塞路易斯加西亚洛佩斯，埃斯特雷利亚科尔提斯鲁比奥，豪尔赫阿隆索帕拉西奥斯，恩卡纳西翁梅拉多杜兰，布鲁诺迪斯加西亚，何塞曼努埃尔吉桑塞哈斯，弗朗西斯科萨尔托马尔多纳多，何塞路易斯巴雷多富恩特，
申请(专利权)人：抗生素有限公司，
类型：发明
国别省市：ES[西班牙]