修饰的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制蛋白制造技术

本发明专利技术公开了修饰的广谱的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂蛋白质，其具有至少相同的，在大多数情况下比相应的野生型成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂蛋白质高的生物活性。例示的修饰的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂蛋白质具有修饰的Ｎ－末端区，特别是包括一个或多个缺失和／或突变。也公开了制备和使用修饰的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂蛋白质的方法，特别是在其中期望抑制细胞生长的环境下。因此本发明专利技术公开提供治疗疾病的方法，例如但不限于特征在于不正常细胞增殖的癌症。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本申请要求在此全文被引作参考未放弃的1997年2月20日提出的悬而未决的美国临时专利申请系列号60/038,118的优先权。按照全国健康协会的拨款号R01-CA 67274和R01-05195以及得克萨斯州高等教育联合会的拨款号ATP004949018，政府享有本专利技术的权利。1.专利
本专利技术通常涉及分子和细胞生物学领域。更具体地说，它涉及成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂。本专利技术进一步涉及本申请修饰的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂在需要提供肿瘤抑制剂或正常细胞生长抑制剂的情况中的应用。2.相关现有技术的说明在美国癌症和肿瘤是导致死亡的第二大最普遍的原因，每年导致约450,000例的死亡。三个美国人中有一个可患有癌症，五个中的一个就死于癌症(科学美国药物，第12部分，I，I，节，注明日期为1987)。虽然在确定癌症的一些可能的环境以及遗传原因方面已取得了实质性的进展，但对癌症死亡速率的统计数据表明在治疗癌症和相关疾病和疾症方面需要实质性的进展。许多基因与癌症的病因学相关。这些基因被确定与癌症的遗传类型以及大量的被透彻研究的肿瘤细胞相关。癌症基因的研究有助于提供对肿瘤发生的过程的一些了解。虽然仍需了解大量有关癌症基因的情况，但目前已知的癌症基因起着了解肿瘤发生的有用的模型的作用。癌症基因广义的被分为当被活化时促进肿瘤发生的“癌基因”和在被损伤时不能抑制肿瘤发生的“肿瘤抑制基因”。虽然这些分类提供了有利的用于概念化肿瘤发生的方法，但取决于该基因特定的等位基因、其调节成分、遗传背景和它在其中操作的组织环境，特定的基因也可能起不同的作用。癌基因为从其野生型等位基因(现有技术将这些野生型等位基因称为原癌基因)突变成在某些情况下能诱导肿瘤发生的形式的体细胞基因。目前有许多关于已知和推测的癌基因和这些癌基因的各种等位基因的文献。例如，癌基因ras和myc被认为用于一般性了解癌基因过程的模型。ras癌基因被编码细胞质蛋白和myc癌基因被认为编码核蛋白。ras癌基因和myc癌基因单独不能诱导正常细胞完全转化为肿瘤细胞，但当ras和myc癌细胞在相同细胞中共同存在并表达时通常发生完全的肿瘤发生(Weinberg，1989)。在许多其它研究的癌基因中已观察到这种协同作用。癌基因的肿瘤发生的协同作用的模型必须通过被正常细胞围绕的表达ras癌基因的细胞不进行完全转化的观察来确定。然而，如果大多数围绕的细胞也表达ras，那么仅ras癌基因就足以诱导表达ras细胞中的肿瘤发生。由于拥有癌基因的细胞的组织环境的变化可能被认为是第二个标的，因此这种观察结果证实了肿瘤发生的多个标的理论。另一个和同样合理的假设是与癌基因，如ras或myc的活化协同作用的事件可能包括负调节因子或因子，即肿瘤抑制蛋白的失活(Weinberg，1989；Goodrich等，1992a)。肿瘤抑制基因为其野生型等位基因的表达抑制异常细胞增殖的蛋白的基因。当编码肿瘤抑制蛋白的基因被突变或缺失时，产生的突变的蛋白或肿瘤抑制蛋白的完全缺乏可能不能正确地调节细胞增殖。这导致异常的细胞增殖，尤其是如果已存在细胞调节机理的损伤时。细胞增殖的控制的缺乏已被与各种人类癌症的发生联系在一起(Weinberg，1991)。许多透彻研究的人类肿瘤和肿瘤细胞系已显示丧失或肿瘤抑制基因异常。肿瘤抑制基因和代表性肿瘤抑制基因的实例包括，但不局限于成视网膜细胞瘤(RB)基因(Friend等，1986；Fung等，1987；Lee等1987a)、野生型p53基因(Finlay等，1989；Baker等，1990)、缺失的结肠癌(DCC)基因(Fearon等，1990a；1990b)、神经纤维瘤1型(NF-1)基因(Wallace等，1990；Viskochi等，1990；Cawthon等，1990)、维耳姆斯氏瘤(WT-1)基因Call等，1990；Gessler等，1990；Pritchard-Jones等，1990)、von Hippel-Lindau(VHL)疾病肿瘤抑制基因(Daun等，1995)、Maspin(Zou等，1994)、Brush-1(Schott等，1994)和乳腺癌BRCA 1基因(Miki等，1994；Futreal等，1994)和多发性肿瘤抑制因子(MTS)或p16基因(Serrano等，1993；Kamb等，1994)。推测的肿瘤因子基因的目录非常大并正在增加，肿瘤抑制基因的总的数量被预期远远超过50个(Knudson，1993)。确定的第一个肿瘤抑制基因为导致遗传成视网膜细胞瘤的成视网膜细胞瘤(RB)基因(Knudson，1971；Murphree和Benedict,1984；Knudson，1985)。于二十世纪八十年代中期被克隆的成视网膜细胞瘤(RB)基因是一个研究得最透彻的肿瘤抑制基因。RB基因互补DNA(cDNA)的约4.71kb的大小使得能很容易地进行基因操作，并导致RB基因插入到许多细胞系中。在大多数成视网膜细胞瘤、软组织和骨肉瘤以及约20％-40％乳腺、肺、前列腺和膀胱癌中RB基因显示为失去或缺失(Lee等，WO90/05180；Bookstein等，1991；Benedict等，1990)。克隆的RB基因的确是肿瘤抑制剂基因的最直接的证据是在来自RB基因的被克隆的完整拷贝的导入的RB-负型肿瘤细胞中的肿瘤抑制功能的所观察的发现。许多报道表明在来自不同类型的人类癌症的RB缺损肿瘤细胞中的正常RB基因的取代可抑制其在裸鼠中的肿瘤发生活性(Huzamg等，1988；Goodrich和Lee，1993；Zhou等，1994b)。研究的肿瘤细胞系来源于各种不同类型的人类癌症，如成视网膜细胞瘤、骨肉瘤、膀胱、前列腺、乳腺和肺癌。虽然观察到功能性的野生型全长成视网膜细胞瘤基因(RB110)导入RB负型肿瘤细胞使细胞“正常化”，但未预测到已经具有正常RB110基因表达(“RB+”)的肿瘤细胞将对RB110基因治疗产生应答，因为推测加入的另外的RB的表达不能校正非RB遗传缺损。这事实上已显示了RB+骨肉瘤细胞系U-2OS的情况，其中额外的p110RB编码基因的导入未改变瘤性表型(Huang等，1988)。因此，仍需要用于治疗具有任何类型的遗传缺陷的异常增殖细胞的广谱治疗肿瘤抑制基因。RB110cDNA开放读框序列(McGee等，1989)包含位于核苷酸355-357的外显子3中的第二个框内AUG密码子。从该第二个AUG密码子起始的蛋白缺乏全长RB蛋白的N-末端112个氨基酸残基，并被称为pRB94(Xu等，1994b)。在美国专利5,496,731(被本文引作参考)中，专利技术人指出如通过其未将胸苷掺入DNA所证实的，表达外源pRB94的RB缺损肿瘤细胞在细胞周期中不发展。相反，在产生外源pRB110(野生型pRB蛋白)的细胞中的进行DNA复制的肿瘤细胞的百分数仅略低于RB-细胞。甚至更令人惊奇的是pRB94的表达还显著降低检测的两个RB+(具有正常的RB等位基因)肿瘤细胞系的菌落的形成，即纤维肉瘤细胞系，HT1080和子宫癌细胞系，Hela(Xu等，1994b)，同时当通过使用质粒载体的转染(Fung等，1993)或通过微细胞融合(Anderson等，19本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含编码非ｐＲＢ↑［９４］的修饰的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂蛋白质的分离基因的ＤＮＡ片段，所述修饰的成视网膜细胞瘤肿瘤抑制剂蛋白质包括一个Ｎ－末端修饰。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HJ徐，SX胡，WF贝内迪特，YL周，
申请(专利权)人：得克萨斯系统大会评议会，贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]