流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法技术

流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，选取工作毒种，接种８－１１日龄鸡胚并于３４℃孵化，４８－７２小时后收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，过柱层析，半成品检定，单价病毒悬液合并，静水压灭活，成品检定，终产品分装及包装，是利用当代高压物理学与生物学技术结合的一种尝试，它不仅保留流感全病毒完整结构不被破坏，而且病毒又完全灭活，同时抗原的免疫原性又不受影响而且还有有所提高，对流感病毒变异性，变种多非常适宜，而且工艺简便，生产周期短，总成本低，能满足现代工业化规模生产。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物制品中流感病毒灭活疫苗，特别是。流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型病毒传染性最强且容易发生变异，传播速度最快。流感病毒经常不断发生抗原变异，出现新的亚种，一般10-15年发生一次世界范围内的大流行；区域性流行春秋常在各地发生。注射流感灭活疫苗是一种有效的预防流感的方法。制备流感疫苗必须采用WHO推荐毒株结合各国实际情况用甲1、甲3和乙型三价流感病毒来制作灭活疫苗。灭活剂的选择及应用方法，是灭活疫苗制备上的关键技术。化学试剂甲醛(福尔马林)是应用最早最广泛的灭活剂，从1941年美国批准用甲醛灭活制备流感病毒灭活疫苗以来一直沿用至今。由于甲醛易使病毒粒子表面蛋白抗原受损，往往影响疫苗的免疫原性。同时甲醛又有一定的刺激性，有一定的副作用。人体接种这种疫苗局部和全身反应都较强。为了解决甲醛灭活存在的问题，本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使流感病毒纯化操作大大提高，制成了流感全病毒灭活疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。为了使不良反应减少，接着又研制出多种裂解剂，如乙醚，3-N-丁基磷酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脱氧胆酸钠(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(Triton X100)等，生产出了裂解疫苗，此种疫苗1986年在美国首次被批准使用。本世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了流感病毒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英国在临床试用中，证实了免疫效果与裂解疫苗相同，并可用于儿童。1980年英国首次批准使用，而后扩展到其它国家。在实践中发现，流感病毒亚单位和表面抗原疫苗接种后虽然不良反应有所减少，但其免疫原性都不如纯化的全病毒粒疫苗，从而又开展了佐剂研究工作。利用佐剂来提高免疫效果的。用B30-MDP[6-0-(2-14烷基16烷酰“2-tetradcylhexdecanoyl”)-N-乙酰胞壁酰“N-acetylmuramoyl”-L-丙氨酰“L-alanyl”-D-异谷氨酰胺“D-isoglutamine”和纯化的流感病毒颗粒HA、NA抗原、胆固醇及去污剂(Octyl glucoside-辛基苷)相混，通过超声波使之充分混合，溶解，然后经过纤维素去除去污剂。这样就能使流感毒粒HA和NA亚单位内部和外表面相互附着成微脂粒的薄片状结构，其直径约为100nm，类似于一个完整的流感病毒颗粒。这种疫苗，日本已开始在志愿者试用，抗体阳转为理想，但仍有副反应，如注射部位有疼痛和红肿等。本专利技术的目的是针对现有技术的不足，应用现代高压物理学与生物学互相交叉渗透建立起来的一种理想方法，既流感病毒静水压灭活疫苗方法。它不仅保留流感全病毒完整结构不被破坏，而且病毒又能完全灭活，同时抗原的免疫原性又不受影响而且还有明星提高，对流感病毒变异快，变种多非常适宜，而且工艺简便，生产周期短，总成本低，能满足现代工业化规模生产。流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的操作方法，取工作毒种，接种8-11日龄鸡胚并于34℃孵化，48-72小时后收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，过柱层析，半成品检定，单价病毒悬液合并，静水压灭活，成品检定，终产品分装及包装。一、静水压、高压设备及其工作原理1、静水压静水压是流体静压力的简称。将固体、液体和气体均视为连续介质。在外力作用下，各部分介质通过它们之间的分界面互施大小相等、方向相反的作用力，称作用在单位界面上的力为应力。可以把应力分解成两个分量一个垂直于作用面，称为正应力，常用σ表示；另一个在作用面内，称切应力，常用T表示。可以证明，介质内任一点的应力状态可以用对称的应力张量来表示，应力张量共有9个分量，表示为 其中，σx、σy、σz分别是介质的其余部分对介质内的体积元在x、y、z方向的正应力；Tij(I，j＝x、y、z)是6个切应力，前一个足标代一切应力的方向，后一个足标代表切应力作用面的外法线方向。定义压力为 p＝-(σx+σy+σz)/3，即压力的大小等于所考察点上的3个正应力的平均值，负号表示压力的作用方向与过该点的作用面的外法线方向相反。特殊地，如果流体处于静止状态，或者虽然处于运动状态，但是流体是无粘性的，其6个切应力分量都等于零，只有3个正应力不为零。可以证明σx＝σx＝σz＝-P，即静止流体或无粘流体的压力等于任一方向正应务的负值，称这样的压力为流体静压力。概括的说，静水压状态的特点是切应力为零，正应力各向同性。在高压科学技术研究中，一般称接近静水压的状态为准静水压，称远离静水压力的状态为非静水压。在压强的实验测量中，实际测量的是某一有限面积上的正应力。当该面积处于流体当中时，由于平衡态下满足静水压条件，压力分布是均匀的，于是用单位面积上的力可以把压强确定到相当高的精度。高精度静水压的获得，与所选用的传压介质的剪切强度有关。所谓的传压介质是指传递压力的媒介物质。流体传压介质的基本功能是把施于其上的轴向压力转变成作用到试样上的均匀压力，即转变成静水压力。此外考虑到使用时的可靠、方便与安全，还要求传压介质具有下列物性化学惰性，渗透率及压缩率低，容易操作，容易密封，价格低廉。根据不同的使用要求和压力范围，可选用不同的气体、液体或固体作为传压介质。一般地说，转变成静水压的能力方面，气体最佳，液体次之，固体最差，即使选用剪切强度很低的软固体也只能获得准静水压。常用的液体介质有甘油、变压器油、煤油、汽油、石油醚、戊浣与异戊烷的混合液以及水等。二、静水压机设备简介及其工作原理常温常压静水压机由超高压容器、超高压力源及配套的管路附件系统组成。它使受压制品得到各向均匀的超高压力作用。超高压腔体积一定，通过不断增加腔体内油密度来改变腔体内压力，达到升压的目的。加压在常温下进行。升、降压过程在几秒或几十秒内完成，因此在操作过程中，可将整个系统视为绝热状态，与外界无热交换，即Dq＝Tds≈0。由于在升、降压过程中系统对外分别做负功和正功，因而系统内部有微小的温度起伏，但并不影响病毒的存活。所以，病毒的灭活完全是由压力所致，而不是温度造成的。三、流感三价全病毒混合悬液静水压灭活操作方法1、根据流感病毒疫苗生产规模大小，引进或加工制造适于生产规模产量的静水压机，进口自动化程度高，自己加工制作的一般手工操作，中、小型静水压机日本有定型产品出售；大规模生产的静水压机瑞典生产；我国上海大龙机械厂能加工制造；2、选定好静水压机，安放于符合药品GMP生产流程要求的4-8℃无菌室内，按通电源，调节电压、检测、调试至符合生产要求的各项参数指标。3、流感三价全病毒浓缩悬液，经检定合格后，装于500ml软塑料采血袋或软塑料输液袋内密封好，置于4-8℃冰箱保存备用，防止冻融，也可以加工制式的软塑料袋专供装流感病毒悬流，根据规模而定250ml-5000不等规格。4、将静水压机密封高压腔打开，置放好装有流感三价全病毒悬液采血袋或塑料袋，选用好传压介质、密闭高压腔，接通电源，调节电压，选定200-300Mpa、静水压20-40分钟；5、流感三价全病毒悬液经静水压处理后及时存放于4-8℃冰箱。本专利技术创造是利用当代高压物理学与生物学技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，取工作毒种，接种８－１１日龄鸡胚并于３４℃孵化，４８－７２小时后收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，过柱层析，半成品检定，单价病毒悬液合并，静水压灭活，成品检定，终产品分装及包装。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苟仕金，苟鸿鹰，王成余，
申请(专利权)人：辽宁天成生物制药研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]