链格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法技术

本发明专利技术为链格孢菌液体培养的粗代谢产物用于控制杂草的方法，属于微生物应用于农业植物保护领域。直接利用其粗代谢产物的混合物原液，经水稀释１５倍以内至浓缩１０倍间，喷施于杂草茎叶上，在４８小时内致杂草迅速死亡，这些杂草包括了主要的阔叶杂草、禾草和莎草，具广谱性。所用的液体培养基为玉米和黄豆粉液体培养基、马铃薯蔗糖液体培养基。亦可以小麦粒固体培养基进行培养。施药５小时即可引起杂草明显的受害症状，症状表现是使杂草萎焉，接触药液处形成伤害，具有显触杀型的特点。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为，属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的
，专用于农田杂草的防除。微生物代谢物治草是以微生物的代谢产物或从微生物中分离得到的植物毒素作为除草剂治理杂草的一种方法。现已成为研究和开发的重点或热点。这类除草剂在贮存、应用、制剂的相容性和半衰期方面都比活体微生物更优越，且不会使非靶标植物染病，其药效通常也不依赖于环境因素，便于预测。茴香毒素(Anisomycin)是链霉菌代谢的产物，能强烈抑制稗草和马唐等杂草。“无公害”除草剂甲氧苯酮就是根据茴香霉素仿制而成的一种水田除草剂，对水稻和稗草有高度的选择性，抑制稗草叶绿素形成，产生白化而致死。青霉菌属(Penicillium frequentans)中的11个种，经发酵后能产生N-甲酰基羟氨基乙酸，可杀死马唐及一些双子叶杂草。金色假单胞杆菌(Psendomonasaurecafaciens)的发酵产物吩嗪-1-羧酸与2羟基吩嗪-1-羧酸，每英亩10磅的剂量可防除狗尾草、水田芥和水生植物蓝绿藻和浮萍(Lemna sp．)等。这其中最著名的要数双丙氨膦，它是由吸水链霉菌(Streptomyces hygruscopicus)发酵的产物，在日本广泛地的应用。根据双丙氨膦的化学结构研制开发出的灭生性除草剂草胺膦(草丁膦)，在欧美国家广泛应用。并且，利用转基因技术研制开发出抗草胺膦作物，被广泛栽培，进一步，扩大了该除草剂的使用范围。利用链格孢菌的活孢子作生物除草剂，防除杂草已有很多报道。但是，利用代谢产物进行除草，仅有以AAL-toxin毒素和交链孢酸为主要的有效成分进行除草的报道。AAL-toxin毒素的杀草作用申请了专利。在该专利中，曾提及含有该毒素的粗提物的除草活性，其主要有这些特征是主要针对某些阔叶杂草如龙葵、曼佗罗、弗吉尼亚合萌、大果田菁等，对禾本科杂草几乎无效；粗提物是以固体培养基如玉米粉或大米进行固体培养后，经水洗过滤而获得的过滤液，具活性的浓度在1000ppm以上等。交链孢酸也有类似的仅对阔叶草有效的特点。但是，这两种毒素除草的种类较少，不能防除禾草与莎草，对阔叶草的防除种类亦少；固体培养生产能力相对较低，不适于大规模工业化生产。我国目前尚未有一种生物除草剂产业化，客观上推进生物除草剂的产业化，将改变我国目前除草剂的产品结构，农药化工的产业结构，以及满足绿色和有机食品生产对无公害除草剂的需求。本专利技术的目的是针对现有链格孢菌毒素不能防除禾草与莎草，对阔叶草的防除种类亦少；固体培养生产能力相对较低，不适于大规模工业化生产的缺陷，提供一种，直接利用含有植物毒素活性成分的链格孢菌粗代谢产物作为生物源化学除草剂，用于生物除草，作为广谱性除草剂，茎叶喷雾处理，安全有效地控制禾本科杂草、阔叶草和莎草。适于大规模工业化生产的培养技术。对环境污染小，杀草谱广、杀草迅速。本专利技术，其内容和实施方案如下链格孢菌的粗代谢产物用于控制杂草的方法为直接利用链格孢菌(Alternariaalternata(Fr．)Keissler)经PDA培养的菌种培养物小块，采用液体培养或小麦固体培养基培养，过滤掉活菌丝及其它活性细胞后，其粗代谢产物的混合物原液，经水稀释15倍以内至浓缩10倍间，其中粗代谢物的作用浓度在1000μg／ml以下。喷施于杂草茎叶上，在48小时内致杂草迅速死亡，这些杂草包括了主要的阔叶杂草、禾草和莎草。液体培养方法为玉米和黄豆粉液体培养基(SCSC)、马铃薯蔗糖液体培养基(PSK)、紫茎泽兰叶汁培养基等液体培养基之一种PSK培养基200g土豆水煮过滤液(四层纱布过滤)，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。SCSC培养基15g玉米粉+15g黄豆粉，30g蔗糖，3gCaCO3，加水至1L。紫茎泽兰叶汁培养基200g紫茎泽兰叶水煮过滤液，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。每1升培养液置于3升左右容积的培养瓶中，在23-26℃温度下，黑暗或12小时光照／12小时黑暗交替，静置或震荡(110转／分钟)培养5-8天。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0．45μm微孔薄膜过滤，得无菌滤液。小麦粒固体培养基称取100g，装入500ml的三角瓶中，用清水淘净后，再浸泡10h，除去多余水分，置于灭菌锅中灭菌30分钟(121℃)，冷却后接种链格孢菌株，于25℃、12hL(光)／12hD(暗)的条件下培养，每天摇动1-2次三角瓶，避免结块，3周后取出培养物，80℃下烘干，粉碎，然后用乙酸乙酯抽提3次，常压蒸馏回收乙酸乙酯，得粗毒素。无菌滤液经稀释15以内至浓缩10倍间，可以加入1-5％的助剂，助剂为非离子型表面活性剂、植物源助剂以及渗透剂。主要种类有增效剂SD(SD)、十二烷基苯磺酸钠(12WB)、农乳100号(NR100)以及0．01-0．5％渗透剂等。喷雾于2-5叶期的杂草幼苗上，经5小时以上，杂草幼苗出现萎焉症状，再经2天左右时间并可以完全杀死杂草。可以杀死马唐、牛筋草、光头稗、稗草、野燕麦、看麦娘、日本看麦娘、菵草、硬草、牛毛毡、鳢肠、铁苋菜、猪殃殃、大巢菜、稻槎菜、藜、牛繁缕、雀舌草、节节菜、鸭舌草、播娘蒿、鸭趾草、水花生、反枝苋、野苋、荠菜等农田主要的阔叶杂草、禾草和莎草。专利技术人在对紫茎泽兰的生物防治研究过程中发现了野外紫茎泽兰的自然发病现象，故对其寄生真菌进行筛选研究。分离获得了链格孢菌(Alternaria alternata(Fr．)Keissler)菌株，对其生物学特性、致病性及致病机理进行了深入的研究，发现其致病的主要作用机理是致病植物毒素的产生。通过对链格孢菌经液体培养后滤除活菌后的培养残液，测试培养残液、提取的粗毒素、以及分离提纯的毒素的除草生物活性，发现在1-1000μg／ml以内就能使杂草产生明显的毒害症状，引起毒害症状的最快时间在5小时，2天内可以完全杀死杂草。研究发现对供试的94种植物中，仅有3种不敏感。粗毒素的制备是将菌株按上述的条件培养后，将培养液用4层纱布过滤，再用普通滤纸抽滤，取滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，将乙酸乙酯蒸馏回收，得粗毒素。粗毒素经少量无水酒精溶解，再用水稀释至特定浓度，处理杂草。链格孢菌毒素溶液处理的部位，明显受害，症状的出现最快时间在5小时，致48小时，受处理的杂草部位完全坏死。毒素的毒害作用，仅限于受药剂处理的部位，几乎没有传导。链格孢菌毒素影响杂草离体叶片细胞膜的透性，随着毒素浓度的增加，浸出液的相对电导率上升。当毒素浓度从1增加到2．5μg／g时，浸出液的相对电导率变化很小，而当毒素浓度从2．5增加到5μg／g时，浸出液的相对电导率变化很大，增加2倍多，当毒素浓度再增加时，浸出液的相对电导率上升很小，这个结果表明，毒素的吸收可能与膜上受体有关，当受体被饱和后，相对透性不再受毒素浓度的影响。链格孢菌毒素能引起紫茎泽兰叶组织K+和Na+的渗漏，随着毒素浓度的增加，浸出液中K+和Na+的含量上升。引起细胞膜透性改变是致病毒素作用于寄主后发生的普遍性的反应。菌株产生的致病毒素能引起杂草离体叶片细胞膜的透性上升，K+、Na+的渗漏，叶组织的膜脂过氧化加剧，说明致病毒素引起细胞膜的伤害，造成膜功能的紊乱。致病毒素处理后，杂草离体叶片的过氧化物酶(POD)、抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法，其特征在于：直接利用链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ （Ｆｒ．） Ｋｅｉｓｓｌｅｒ）经ＰＤＡ培养的菌种培养物小块，采用液体培养或小麦固体培养基培养，过滤掉活菌丝及其它活性细胞后，其粗代谢产物的混合物原液，经水稀释１５倍以内浓缩１０倍间，喷施于杂草茎叶上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：强胜，万佐玺，董云发，李扬汉，朱春林，戴宝江，
申请(专利权)人：南京农业大学，南通江山农药化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]