转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆的方法技术

本发明专利技术涉及一种电转移技术将抗菌肽基因导入家蝇受精卵，获得高效表达，繁育蝇蛆的方法，这种转基因家蝇在无限繁殖的蝇蛆的过程中设计合理营养蝇胆的饲料配方，优化繁育条件，在分离蝇蛆后利用渗透压关系加适量缓冲流，降低氧含量，再用物理学方法超声波诱导蝇蛆，以增加高活性抗菌肽在蝇蛆中的含量。按制药用抗菌肽原料要求，进行无菌繁育转基因抗菌肽工程家蝇，进行规模化饲养。用本法构建的工程蝇传代稳定，表达高，投资成本低，周期短，工艺简便，产率高，适用于产业化规模生产，宜于普及推广。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程生产抗菌肽药品的生物
，特别是。抗菌肽是瑞典科学家Boman于1980年首先从异古比天蚕中发现的，后来科学家们又从其他蚕类和蝇类发现多种杀菌肽。在80年代人们都是从昆虫中分离纯化杀菌肽，并进行了结构分析及生物学活性的研究。结果表明抗菌肽是一类碱性小肽，等电点9-10，由33-39个氨基酸残基组成，C-末端酰胺化、水溶性好、对热稳定、分子量仅4Ku左右，因此无抗原性；生物学活性表明抗菌肽可抗细菌、抗肿瘤细胞，还有抗病毒作用，其作用机制是集菌分子直接插入细胞膜，造成孔洞而使上述细胞崩解而死亡。因此对抗生素耐药菌株均有杀伤作用，若抗菌肽应用于临床，对于那些由耐药菌感染的疾病病人无疑是个福音。近年来感染性疾病又重新肆虐全球发病率逐年上升，这一方面是由于新的病毒或致病菌的出现，另一个重要方面是很多致病菌对现有抗生素产生抗性而耐药。据统计，每年全世界各种传染病死亡人数高达1700万，占总死亡人数1/3，人们渴望着新的抗菌药问世！抗菌肽在医学上的应用，目前研究的焦点主要是进行新的多肽设计和改造，采用统计学方法在微机上进行计算，选用Chou-Fasman的程序计算α螺旋、β折叠和转用的结构分布，选用Kyte-Doolittle公式计算疏水区域的颁，选用Friti-Jahning的方法判断两亲结构。Jaynes等人报告在Cecropin B基础上，设计的新的抗菌肽对种瘤细胞和某些病毒有较好疗效。美国的马盖宁制药公司于1987年开始致力于Magainin的商业性研制，现已马盖宁(一种蛙皮肽)作为人用药。2000年批准上市后，当年销售额即达10亿美元。在当今细菌菌株已对现有的抗生素类药物产生抗药性之际，人们赞誉“马盖宁”象当年青霉素那样，具有巨大的应用潜力。家蝇作为“四害”之一，多少年来被人们深恶痛绝，甚至每年都要耗费大量的人力、物力、财力消灭它，但总是周而复始，灭而不绝。这主要是由于家蝇自身所具有的独特的免疫力及高效的繁殖能力和顽强的生命力，如果以一种逆向思维来考虑，利用其特性开发利用便可变害为利。其实，苍蝇一生下来的蝇蛆是很干净的，它本身并不生产细菌和疾病，只是变成成虫才接触外界的肮脏处沾染了各种细菌，严格地说它只是一种媒介生物，好像蜜蜂无意传授花粉一样，苍蝇无意传播细菌。苍蝇一旦被人工饲养、利用，避免与外界接触，便改了一个好听的名字叫工程蝇或无致病菌苍蝇。由于家蝇具有其生长繁殖快，生活周期短，产孵量巨大，饲养成本极低等特点，所以家蝇已成为人类的新资源。现代研究证实，抗菌肽广泛存在于动物(昆虫)，植物和微生物中，采用纯化方法难以获得大量的抗菌肽。本专利技术的目的是提供一种外源性抗菌肽，用基因工程方法实现转基因蝇蛆抗菌肽苍蝇的高效表达，为工厂化生产奠定了坚实基础。，用抗菌肽Shiva-1的氨基酸基因序列，加上适宜基因工程操作的酶切位点，经人工合成2条分别为92bp和91bp的寡聚核苷酸片段，互补链延伸反应，EcoRⅠ酶切，将完整的Shiva-1基因反向克隆至pU18载体，经PCR检测和序列分析，正确的克隆了抗菌肽Shiva-1基因，为E.coli融合表达及转基因家蝇受精的先决条件；用BAEKON6000型基因转移仪，在脉冲电压(AMPLITUDE)为1500V、脉冲时间(BRUST TIME)为15000ms、脉冲数(NUMBER OF PULSES)为1000、脉冲宽度(PULSE WIDTH)为100US、周期(CYCLE)为50、距离(DISTANCE)为2mm的条件下，使抗菌肽重组质粒Shiva-1在家蝇染色体上实现整合。一、三种基因药物生产方法之比较。从基因的发现到转基因小鼠的问世，几乎经过了一个世纪，确实说明了影响深远的基础研究成果转化为应用技术的不容易。可是，一旦获得首创性突破，就会呈现迅猛发展趋势。转基因技术也是如此，自从“巨鼠”出世以后，转基因技术的研究犹如雨后春笋，国内外竞相研究，幻想与成果此起彼伏，不断出现，形成了科学幻想与现实同行之趋势。转基因动物作为一门只有十几年历史的高新技术成果，既具有深远的理论研究价值，又具有重大的应用价值。转基因动物研究需要应用动物胚胎学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学，遗传学和基因组学等众多基础生物学科的理论知识和技术成果，而转基因动物的研究成果又帮助和促进这些学科的发展。在转基因动物的实际应用方面，涉及生物医学、农牧业和药物产业等诸多方面，其价值之大，作用面之广已越来越被人们所认识。在基因药物质三个发展阶段中，其表达系统的层次不一样，即从原核细胞(细菌等)真核细胞(人类或哺乳动物细胞)再到个体。转基因动物是一种个体表达系统，也是最复杂、最具有前景的生物表达系统。目前对三种基因药物生产方式之比较，转基因药物成本和制药成本是最低的，而转基因蝇蛆抗菌肽又是转基因药物之中最低的。因此蕴含着巨大的经济效益。二、抗菌肽基因合成与克隆抗菌肽(Antibacterial Peptides,ABP)是昆虫等动物产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，研究发现它有广谱抗细菌、抗病毒的功能，对真菌、原虫也有作用，甚至有抗肿瘤活性，由于抗菌肽有重要的临床作用价值，其研究进展十分迅速，其中许多抗菌肽的cDNA已被克隆测序。用基因工程手段将抗菌肽基因导入动植物体内进行表达，可望用抗菌肽杀死侵入机体内的病原，建立高效抗病的转基因动植物，也可采用融合表达方式在E.coli-1的氨基酸序列，兼顾鱼类、昆虫和大肠杆菌偏爱的密码子，设计其基因序列，加上适宜基因工程操作的酶切位眯，经人工合成2条分别为92bp和91bp的寡聚核苷酸片段，互寂链延伸反应，EcoRⅠ酶切，将完整的Shiva-1基因反向克隆至Puc18载体，经PCR检测和序列分析，正确的克隆了抗菌肽Shiva-1基因，为E.coli融合表达及转基因蝇蛆抗菌肽提供了关键技术环节，见附图说明图1抗菌肽基因合成图、图2抗菌肽基因从组于质粒裁体图。三、用电转移技术及抗菌肽基因导入家蝇受精卵以抗菌肽Shiva-1基因为靶基因，利用BAEKON6000型基因转移仪进行了家蝇转基因是将收集家蝇(Musca Domcstica)新产受精卵(1-1.5小时内)，在脉冲电压(Amplitude)1500V、脉冲时间(Brust Time)1500ms、脉冲数(Number,of Pluscs)1000、脉冲宽度(Pulse Width)100us、周期(Cycle)50、距离(Distance)2MM、PH值6.0-8.0及离子浓度为0.001-0.01mol/L缓冲夜等条件下，将10u/ml环状质粒DNA与家蝇卵混合后进行转移，取转移后人工孵化24-36小时的家蝇幼虫，提取染色体DNA，通过PCR特异片段扩增及Southern检测，证明抗菌肽Shiva-1基因在家蝇染色体上实现了整合，而且遗传至子代，应用本方法建立的电转移条件对家蝇进行基因转移，成活率在20-40％之间，外源基因在成活家蝇的整合率在10％左右，同时本法具有操作简便、快速等特点。要十几分钟就能完成数百枚卵的基因导入。见图3转基因抗菌肽家蝇技术路线图。四、转基因抗菌肽家蝇蝇蛆的饲养将转基因抗菌肽幼蛆接种放入已配合好的蝇蛆饲料中，饲料配方按麦麸、奶粉、白本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆的方法，用抗菌肽Ｓｈｉｖａ－１的氨基酸基因序列，加上适宜基因工程操作的酶切位点，经人工合成２条分别为９２ｂｐ和９１ｂｐ的寡聚核苷酸片段，互补链延伸反应，ＥｃｏＲ Ⅰ酶切，将完整的Ｓｈｉｖａ－１基因反向克隆至ｐＵ１８载体，经ＰＣＲ检测和序列分析，正确的克隆了抗菌肽Ｓｈｉｖａ－１基因，为Ｅ．ｃｏｌｉ融合表达及转基因家蝇受精的先决条件；用ＢＡＥＫＯＮ６０００型基因转移仪，在脉冲电压（ＡＭＰＬＩＴＵＤＥ）为１５００Ｖ、脉冲时间（ＢＲＵＳＴ ＴＩＭＥ）为１５０００ｍｓ、脉冲数（ＮＵＭＢＥＲ ＯＦ ＰＵＬＳＥＳ）为１０００、脉冲宽度（ＰＵＬＳＥ ＷＩＤＴＨ）为１００ＵＳ、周期（ＣＹＣＬＥ）为５０、距离（ＤＩＳＴＡＮＣＥ）为２ｍｍ的条件下，使抗菌肽重组质粒Ｓｈｉｖａ－１在家蝇染色体上实现整合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苟仕金，苟鸿鹰，王成余，
申请(专利权)人：辽宁天成生物制药研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]