制备基因库的方法技术

本发明专利技术涉及从生物的环境库中制备基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的ＤＮＡ。本发明专利技术还提供了从生物的环境库中筛选目的ＤＮＡ序列的方法。本发明专利技术进一步涉及从生物的环境库中制备的基因库，该环境库富含编码具有目的活性的多肽的ＤＮＡ。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从生物的环境库中，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA。
技术介绍
重组DNA技术的出现使得筛选具有目的特性的单个蛋白成分并且大量生产它们成为可能。这代表了对以前使用的生产方法的改进，以前的生产方法是应用从自然中分离的微生物而且生产蛋白质混合物，然后直接应用或在生产步骤之后进行分离。人们已经发展了用来快速鉴定编码目的多肽的基因的方法。在WO93/11249(Novo Nordisk A/S)中叙述了所谓的表达克隆技术的实例。在WO93/11249中公开的技术包括从生物中制备DNA文库，该生物被怀疑携带编码具有产生目的活性的多肽的基因。传统上，用从单个已知的微生物中分离的DNA产生这样的文库。WO97/37036中设计了筛选具有可选择特性的微生物的区域化方法，并且在WO97/37036中叙述了用于从环境样本中制备标准化的基因组DNA文库的方法。然而，从未有人描述从生物的环境库中制备基因库(其中该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA)的方法。因此，需要建立基于生物学富集从生物的环境库中筛选潜在的目的基因的方法。专利技术概述已发现可应用生物学富集从生物的环境库中筛选潜在的目的基因。因此本专利技术提供了从生物的环境库中产生基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA的生物，和b)从所富集的生物库中制备基因库。本专利技术还提供了从生物的环境库中筛选目的DNA序列的方法，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA序列的生物；b)从所富集的生物库制备基因库；c)筛选包含携带有目的基因之DNA的文库；和d)筛选从步骤c)中获得的目的DNA序列。专利技术详述本专利技术的目的是提供从生物的环境库中，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA的生物，和b)从所富集的生物库中制备基因库。在本专利技术中，术语“生物的环境库”意指环境样本，该样本包括微生物和高等动物的细胞，它们含有编码具有目的活性的多肽的DNA。例如，环境样本可以是土壤或植物物质、动物或昆虫的粪便、昆虫的内脏、动物的胃等环境样本，海水或湖水、污水、废水等水样本，污泥或沉淀样本等，这些样本包含一种或(在大部分情况下)大量的不同微生物或活细胞。在步骤a)中，培养所述样本，且不需要进一步纯化。通过选择培养样本的培养基和培养条件，可富集或(扩增)在特定培养条件下具有最佳生长并且表达具有适应于培养条件之特点的多肽。在步骤b)中制备的文库可以通过在本领域中任何已知的适当技术进行制备，并不限定于实施例3和实施例4中叙述的实例。本筛选方法的优点主要是新基因的分离，及所致新产物的产生速度大大提高。而且，本方法允许对多个多肽活性进行筛选，并且可以导致分离编码同类多肽的几个不同基因。通过利用本专利技术，可开发用于分析新酶和其它具有目的活性的多肽的富集培养物。在优选的实施方案中，本专利技术的方法包括在培养基中培养生物的环境库，该培养基含有针对具有目的活性的多肽的底物。可用于富集含不同类型基因产物之生物环境库的底物有很多。例如，编码具有目的活性的多肽(例如果胶酶)的DNA可用其底物(如果胶)进行筛选。在优选的实施方案中，底物构成培养基的碳源和/或氮源。在更优选的实施方案中，底物包括果胶、直链淀粉、纤维素、半乳聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖、脂类、半纤维素或者它们的组合。在本专利技术方法的优选实施方案中，富集是通过一个或更多的生长条件完成的。在另一个优选的实施方案中，所述生长条件包括pH值和温度。而在另一个实施方案中，被用来完成富集步骤a)的生长条件包括任何pH值范围，即pH0-12，优选约pH6-9，特别是pH9-12，以及任何温度范围，即0-120℃，优选约25-30℃，优选约30-50℃，更优选50-70℃。在用于筛选潜在的目的生物环境库的方法中，重要的步骤是选择最佳起始库。为了选择可分解植物(或动物)来源的天然化合物的多肽的编码DNA，优选观察可有效分解这类起始物质的天然群落生境。在分解植物物质中特别有效的动物的实例是反刍动物、白蚁和昆虫(sensu lato)。在优选的实施方案中，从动物的胃或昆虫内脏中分离微生物库。在更优选的实施方案中，从牛的瘤胃中分离微生物库。同样，当筛选编码具有目的活性(即能在诸如强碱性条件下工作)的多肽的DNA时，重要的是从同等强碱性群落生境中分离微生物库。本领域中众所周知，为了使苏云金杆菌(Bt)毒素具有活性，强碱性条件是必须的。已知对Bt毒素敏感的昆虫目幼虫的内脏包含强碱性(pH约为10)环境库。这样的昆虫目尤其是指等翅目、鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫。因此在优选的实施方案中，从等翅目、鳞翅目、鞘翅目或双翅目昆虫的内脏中分离微生物库。在更优选的实施方案中，从选自地夜蛾属(Agrotis)、Neotermescastaneus、幕谷蛾(Tineola bisselliella)和五月鳃金龟(Melolontha vulgaris)的昆虫的内脏中分离微生物库。在从动物胃或昆虫内脏中分离生物的环境库之前，可用包含针对目的多肽活性之底物的食物饲养或提供给动物或昆虫甚至可以作为主要的碳源和/或氮源，如此进行富集是有利的。这使牛的瘤胃和来自鳞翅目、鞘翅目以及双翅目幼虫的内脏对于进一步经特异性底物饲养动物富集非常有利。在优选的实施方案中，通过给动物或昆虫提供食物对微生物库进行富集，该食物包括针对具有目的活性的多肽的底物。“编码具有目的活性的多肽的DNA”的具体实施例包括抗微生物活性和其它酶活性。在优选实施方案中，所述基因库富含编码目的酶活性的DNA。在本专利技术的更优选实施方案中，目的活性是选自下组的酶活性磷酸酶、氧化还原酶(E.C.1)、转移酶(E.C.2)；水解酶(E.C3)如酯酶(E.C.3.1)，尤其是脂肪酶和植酸酶，例如糖苷酶(E.C.3.2)，尤其是木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶，例如肽酶(E.C.3.4)，尤其是蛋白酶；裂解酶(E.C.4)；异构酶(E.C.5)；连接酶(E.C.6)在另一个优选实施方案中，目的酶包括蛋白酶、脂肪酶、β半乳糖苷酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β葡萄糖淀粉酶、酯酶、半纤维素酶、过氧化酶、氧化酶、漆酶或葡萄糖氧化酶。在更优选的实施方案中，用所述方法获得的酶是淀粉酶，尤其α淀粉酶或β淀粉酶、阿拉伯糖醇酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果胶甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸己酰酯酶、果胶裂解酶、木聚糖酶、纤维素酶、β葡萄糖苷酶、纤维素生物水解酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶(mannanase)和/或葡萄糖醛酸酶(glucuronisidase)。包含编码具有目的活性的多肽的DNA的生物的环境库通常是微生物，例如真细菌、古细菌、真菌、藻类和/或原生动物。多肽可以是从任何已知生物中获得的目的酶。优选所述酶可来自微生物，尤其细菌、丝状真菌或酵母。在本专利技术的方法中，所述微生物是富集的培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从生物的环境库中产生基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的ＤＮＡ，该方法包括：ａ）对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和／或条件适于在该生物库中富集携有所述ＤＮＡ的生物，和ｂ）从所富集的生物库中制备基因库。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯桑德尔，卡斯滕肖霍尔姆，托马斯谢弗，莱尼兰格，菲奥纳达夫纳，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]