连续分离活性蛋白的方法技术

从植物材料或发酵培养基中活性蛋白的一种分离方法，其中上述的植物材料或酵培养基中提取的存于酶溶液中的活性蛋白用适合的有机溶剂沉淀，在特定反应器中持续的一步反应，反应器中的条件可以调节以获得非变性蛋白的沉淀，该沉淀要经过熟化步骤后再持续分离。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
该专利技术主题是一种新颖的连续分离活性蛋白方法，特别是从植物，发酵培养基和抽提设备中提取的酶。为了解决这个问题，引入合成产生的味道增加剂。这种近似“自然”的方法是要产生一种新颖方式，恢复食物原有的味道，植物类的例如水果和蔬菜的食物尤其是如此。有一种方法，由Hewitt等提出(US2，924，521)包括将酶从新鲜植物材料中抽取出来，在加工方法的最后再重新加入相关的酶恢复食物产品的自然味道。提取植物的酶并且用冷丙酮沉淀几次。象这样的间隔(分批)提取方法很慢，而且条件不能全部重复，从而导致低产率。内源性酶的有效分离在味道恢复方法中是一个关键步骤，有大量的文献描述这种提取或分离内源性植物酶的方法。例如，专利美国4728613描述了一种方法，可将酶富集在油-水互不相溶混和物两相中的一相中。但该酶仍需分离，在该专利中并未描述。该方法需要多步操作，因而较慢而且繁琐。另外，因为酶活性中的一部分在每步都有丢失，所以它的产量较低，与工业生产不一致。一方面，这种方法并不能持续分离植物中的酶，另一方面，所获酶的产量和活性总的来说都较低。该专利技术的目标是要解决这些难题。专利技术概述为了达到这种效果，依照该专利技术，在从植物材料或发酵培养基中分离“活性”蛋白的方法中，特定的反应器里，以合适的有机溶剂一步持续沉淀活性蛋白(活性蛋白存在于从上述植物材料和发酵培养基中提取的酶溶液中)，上述的蛋白是以植物材料的汁为基础制成的，反应器中的条件可调节从而可获得非变性的蛋白，然后上述的沉淀再持续分离。接触时间，搅拌时间、温度和溶剂的量决定了蛋白沉淀的质量和数量。因而，可以调整这些参数，从而获得非变性蛋白的沉淀。因而，若是酶的话，可以获得“活性”分子。在反应器中沉淀后，进行操作使蛋白沉淀熟化，从而增加组成颗粒的大小。例如，可以通过在持续反应器中用一个垂直涡轮混合或者通过静态混合方法来达到。依照该专利技术，该方法能获得非变性从而有活性的蛋白提取物，特别是酶。运用这种方法，提取物的产量和酶的活性都要比那些用传统方法或分批处理方法的高。该专利技术的另一个主题是一种反应器，它可以允许持续分离大量蛋白。例如，可提取活性更高的果胶甲基酯酶(pectin methylesterasePME)和过氧化物酶(peroxidase POX)以及更高产量的蛋白(见表1)。反应器是由一个有角度，优选的T-型的反应池构成。反应条件可以很容易调整，可针对每种类型蛋白优化方法。与其它反应器相比，该反应器还有一个优点，它几何形状简单，易操作和清洗。该专利技术最终是与获得的非变性蛋白提取物以及用它来重新恢复各种食物产品，例如汤和其它蔬菜产品、婴儿食物的气味和味道相关的。该方法也能运用于“下游加工”的生物
，也就是说，例如在生物发酵中分离由微生物产生的酶。专利技术详述“新鲜味道或气味”可以这样理解，例如新鲜西红柿的味道和气味，即绿色，酸味和光泽，而工业西红柿汁中是没有的。术语“活性”蛋白是指存在于西红柿中现在所知的，与气味和味道部分相关的酶，它为非变性形式。这些活性蛋白，例如酶有过氧化物酶(POX)，酸性磷酸酶(AP)，果胶甲基酯酶(PME)或乙醇脱氢酶(ADH)。在该方法中，可使用的材料有植物材料，水果或蔬菜，也就是说，任何可以食用的植物，举例来说，不论它是种子、根、茎、叶子、花或果实。然而，优选的植物是那些需要增加其天然新鲜味道的，那些天然味道不好或需要它加工后味道的植物特别要避免使用，举例来说尤其是冬笋，豌豆、大豆、马铃薯、谷类食品，sea buckthorn berry和欧楂果。优选植物中，值得一提地是叶菜，如韭菜，茴香，白菜，茎菜；特别是大黄，花椰菜；根菜，特别是胡萝卜，洋葱，萝卜，芹菜，甜菜，块茎，特别是木薯；果菜，特别是西红柿，小胡瓜，茄子，香蕉，苹果，杏，甜瓜，西瓜，梨，李子，桃子，草莓，猕猴桃，mirabelleplum。也可用较高等的蘑茹，它也被认为是植物。特别是例如Agaricusbisporus，Pleurotus ostreatus，Boletus edulis或Leutinusedodes。同样还可以有优势地运用工业植物“废物”，例如，外壳，叶子和树枝。植物材料需制备成汁液的形式，然后处理，这样可以使溶液中含有的酶尽可能多。这种初提取步骤包含实际分离步骤前特定反应器中，溶解最大量的酶。因而，植物材料要匀浆，并调节匀浆液pH至5-8.5优选为7.0，添加盐，例如氯化钠，总盐浓度在0.25-1m之间，优选为0.5M，不溶部分可以经过离心除去。例如，对于每一种酶的最适条件列于表2。所获上清可以冻存也可以直接在反应器中处理，从而分离出活性蛋白。举例来说，西红柿酶的提取量可在50％至100％之间。然后，待分离的酶溶液持续注入一个反应器中，该反应器包含一个池，2个“进口”(酶溶液和溶剂)分支和一个“出口”分支(以沉淀形式的酶的分离物)，“出口”分支优选的形式是和进口呈90°，也就是T-型池，其它角度也是可以运用的。再在反应器中混和有酶的溶液和有机溶剂。溶剂优选醇类，特别是乙醇，或其它来源的有机溶剂，有机溶剂直接通过反应池的一个进口分支注入池中。乙醇优选运用，其最终浓度在40至95％之间(质量浓度)，优选80％。可调节反应器的条件，从而获得非变异蛋白的沉淀。优选时间和冷却温度，使混合物内部保持低温，从而酶不会变性。为了达到这种效果，温度要在-15℃至18℃之间，优选为大约0℃，在通过反应器后，蛋白沉淀与溶剂接触时间在0到30分钟，优选为30秒。分离各种酶的最佳条件为在T型反应器中，终温度为0℃，乙醇最终浓度为80％，沉淀物与溶剂接触的时间为大约30秒。沉淀物的悬浮液是通过出口，优选与酶溶液和溶剂的进口呈90°角，持续排出。悬浮液颗粒的大小在1到2微米之间。在反应器中沉淀后，沉淀物悬浮液需先进行熟化步骤。该步骤可以增加悬浮液颗粒的大小。为了达到这种效果，可以运用连续搅拌的箱形反应器或一种静态混合器。持续条件和混合速率可以调整，以获得足够大小的颗粒或聚合物。因而，沉淀物悬浮液可以近于4℃下在垂直螺旋搅拌下，例如速率100到400rpm的箱中混合(雷诺数1175到4700)，10到60秒，优选为300rpm(雷诺数大约3500)20秒或放入静态混合器，4℃下30秒。熟化后的沉淀物组成聚合物，其大小平均达500微米，然后，沉淀物再持续分离。蛋白沉淀的持续分离可优选用简单的离心获得，沉淀回收然后保存。上清可以去除也可以用一个蒸馏柱处理，因而乙醇可以回收，重新运用于方法中。因而，举例来说所获的酶提取液可以不添加水直接冻存，也可以冻干。酶活性可以保留25％到100％，这些值依赖于酶的易失活程度(表1到3)，例如西红柿，可以得到25％到50％活性的PME，80％到100％活性的POX，70％到100％活性的ADH，80％到100％活性的AP，另外，蛋白分离产量也可在50％到95％之间。依照该专利技术的方法可以获得比常规方法或分批处理方法更多的酶(表4)。依照该专利技术的另一个主题，反应器优选是T-型池(由聚甲基丙烯酸甲醋做成)，没有混和器。例如，这样形状的反应器可以使死体积尽可能地少，进口分支优选在混合容器的底部，两个进口分支直径相同，优选大约1.5毫米，出口分支在容器顶部，与两个进口分支垂直。本文档来自技高网...

【技术保护点】
从植物材料或发酵培养基中分离活性蛋白的方法，其中从上述植物材料或发酵培养基提取酶溶液中的活性蛋白用合适的有机溶剂在特定反应器中持续地一步沉淀，反应器中的条件可调节来获得非变性蛋白沉淀，该沉淀然后继续分离。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P瓦尼里，MC道里，MA朱莱拉特，S克雷利尔，
申请(专利权)人：雀巢制品公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]