经遍在蛋白或黄瓜花叶病毒外壳蛋白肽的N末端融合在高等植物中增加蛋白质生产制造技术

本发明专利技术公开了增加蛋白质产量的方法。一种方法包括通过将编码遍在蛋白的基因插入编码相应蛋白的基因的前面而制备一种载体，并将所述载体插入细胞。由此，一种融合蛋白将被表达，其包括遍在蛋白加上相应蛋白。遍在蛋白Ｃ端水解酶可裂解所述融合蛋白，使所需蛋白呈游离态。这一方法与不包含遍在蛋白基因作为载体的一部分的方法相比，使相应蛋白质的产量增加。遍在蛋白启动子对于获得这种增加的产量不是必需的并因此未使用。第二方法非常类似，只是用编码黄瓜花叶病毒外壳蛋白的１４个氨基酸的基因代替遍在蛋白基因插入相应蛋白质的前面。这一方法导致一种融合蛋白的表达，该融合蛋白包含与相应蛋白质结合的所述外壳蛋白的１４个氨基酸残基。该融合蛋白的产量比当该外壳蛋白基因片段不存在于所述载体中时的蛋白质产量高。在两种方法中，基因可置于异源启动子如３５Ｓ启动子的控制之下。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术背景以异源方式生产蛋白质的策略已经广泛用于生物
，如从宿主细胞中分泌蛋白质(与信号肽融合)，简便检测或纯化蛋白质产物(与报道酶融合进行检测，与肽标记融合以进行纯化)，筛选具有所需生物活性的蛋白质(如在噬菌体展示技术及双重杂交系统中)。相应蛋白质的表达增强也已经通过小肽与靶蛋白的N末端融合而达到。遍在蛋白基因与遍在蛋白启动子一起与相应基因的5’末端的融合是已用于增强蛋白质表达的系统之一。遍在蛋白存在于所有真核细胞中，且是目前已鉴别的蛋白质中最保守的。它在细胞中是高丰度的且呈现对加热和蛋白酶降解的稳定性。另外，遍在蛋白前体，即遍在蛋白单体头尾连结在一起的多遍在蛋白，和单一遍在蛋白在其C端依附于两个小核糖体蛋白之一的遍在蛋白延伸蛋白，经过裂解遍在蛋白基序C端的遍在蛋白C端水解酶的快速加工，释放游离遍在蛋白单体和C端延伸蛋白。所有这些特点都认定遍在蛋白在遗传工程中是增加靶蛋白积累的良好N端融合配偶体。遍在蛋白融合方案首先由Butt等(1989)开发，他示出遍在蛋白与酵母金属硫蛋白的融合，或与腺苷酸环化酶刺激性GTP结合蛋白的α亚单位的融合，在大肠杆菌中使这些不稳定或低表达的蛋白质的产量从不可检测水平提高至总细胞蛋白的20％。Ecker等(1989)表明在酵母中遍在蛋白融合导致三个哺乳动物蛋白的表达增强200倍，且所有这些遍在蛋白融合蛋白均由酵母遍在蛋白特异性内肽酶正确加工，以释放真正的功能蛋白。一种类似的酵母遍在蛋白融合系统由Sabin等(1989)报道，其中遍在蛋白/人γ-干扰素和遍在蛋白α1蛋白酶抑制剂是高表达的，并定量裂解产生具有真正氨基端的γ-IFN和α1-PI。有一些早期报道已经阐述了对在大肠杆菌和酵母中各种蛋白质的遍在蛋白融合表达的大量研究(Baker等，1994；Barr等，1991；Coggan等，1995；Gali和Board，1995；Gehring等，1995；Han等，1994；Kiefer等，1992；Lu等，1990；Lyttle等，1992；Mak等，1989；McDonnell等，1989；McDonnell等，1991；Pilon等，1996；Poletti等，1992；Rian等，1993；Tan和Board，1996；Welch等，1995)。遍在蛋白非常普遍的融合导致细菌中融合蛋白的产量或酵母中裂解产物产量的显著增加。通过遍在蛋白融合所致的外源蛋白的表达增强在植物中也已观测到。在通过驱动烟草原生质体中GUS报道基因的短暂表达，分析烟草多遍在蛋白基因的启动子Ubi.U4的过程中，Gensohik等(1994)发现，从自-263位跨越至第一个遍在蛋白编码单位末端的Ubi.U4片段中缺失内含子序列对GUS活性无可检测的影响，但进一步缺失遍在蛋白编码序列使GUS活性削弱55％。这些研究无一显示遍在蛋白融合异源启动子的直接增强功能。Garbarino和Belknap(1994)观测到启动子加上马铃薯遍在蛋白延伸蛋白基因uBi3的遍在蛋白编码区与GUS报道基因的融合导致GUS活性比在转基因马铃薯中ubi3启动子与GUS基因的直接融合的GUS活性高5-10倍。同样，ubi3启动子和遍在蛋白编码序列对增强GUS活性的协同作用未排除。在另外对马铃薯多遍在蛋白基因ubi7的研究中，相同研究小组(Garbarino等，1995)表明在含有ubi7启动子-5’未翻译序列-内含子-第一个遍在蛋白编码单位的融合构建体中转基因马铃薯植物GUS表达水平，比衍生自只有ubi7启动子和5’翻译序列的表达水平高10倍。然而，内含子和遍在蛋白融合对提高GUS报道基因的表达水平的影响未明显辨别。除上述刊物文章之外，从1989年开始已有一些关于遍在蛋白融合技术的专利申请。如表1所示。本文所用的以例证本专利技术背景或提供额外相关实践的阐述的出版物及其它材料均并入参考，并分别在所附参考文献表中列出。表1相关遍在蛋白融合技术的专利 专利技术概述根据本专利技术的方法，通过将遍在蛋白单体编码序列与蛋白质的编码序列的5’末端融合，可增强蛋白质在植物或植物细胞中的表达。遍在蛋白融合蛋白的表达是通过不同于多遍在蛋白基因或遍在蛋白延伸蛋白基因的启动子的启动子驱动的。因此，蛋白质表达水平的增强是由于5’端附加遍在蛋白单体编码序列所致。此遍在蛋白融合蛋白推测通过植物遍在蛋白特异蛋白酶，在蛋白羧基端76残基甘氨酸处裂解，以产生具有所需生物性质的蛋白质。本专利技术第二方面是黄瓜花叶病毒外壳蛋白的N端14个氨基端残基的肽(NP14)可用作N端融合配偶体，以提高靶蛋白在植物中的表达水平。本专利技术所述的N端融合方案通过真正形式的遍在蛋白融合系统或作为NP14融合系统中的融合蛋白使蛋白质在植物中产量更高。附图简述图1示出烟草ubi.NC89的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。核苷酸序列在序列表中示为SEQ ID NO1，氨基酸序列在序列表中示为SEQ ID NO2。用于PCR中的引物下划线，修改的37-mer寡核苷酸下划双线。图2示出编码CMV CP的14个N端氨基酸(NP14)的合成DNA。此核苷酸序列是SEQ ID NO3，氨基酸序列是SEQ ID NO4。图3例证了遍在蛋白-GUS融合蛋白表达载体pUG的构建。pSKUBC1的核苷酸序列是SEQ ID NO5，pBI221的序列是SEQ IDNO6，pUG的序列是SEQ ID NO7。图4例证了NP14-GUS融合蛋白表达载体pCG的构建。pUCG2的核苷酸序列是SEQ ID NO8。图5例证了遍在蛋白-萤光素酶融合蛋白表达载体pUL的构建。pBIubi中Stul的识别序列中标记的箭头是指遍在蛋白编码区的末端和遍在蛋白融合蛋白的裂解位点。上方pBIubi的核苷酸序列是SEQ ID NO9，下方pBIubi的核苷酸序列是SEQ ID NO10，pUL的核苷酸序列是SEQ ID NO11。图6例证了NP14-萤光素酶融合蛋白表达载体的构建。pCL的核苷酸序列是SEQ ID NO12。图7例证了遍在蛋白-GUS融合体/LUC双报道二元载体pUGL121的构建。图8例证了NP14-GUS融合体/LUC双报道二元载体pCGL121的构建。图9例证了GUS/LUC双报道二元载体pBIL121的构建。图10例证了遍在蛋白融合体克隆载体pBIubi。上面的核苷酸序列是SEQ ID NO13，下面的序列是SEQ ID NO14。图11示出了NP14融合体克隆载体pBINP14。专利技术详述本专利技术涉及增加植物中蛋白质产生的方法和构建物。此方法包括在需要增强表达的基因5’端融合一个增强表达的核酸。本专利技术一方面是将一个遍在蛋白基因插入编码所需蛋白的基因的前面，这样产生一种融合蛋白，其中遍在蛋白直接融合于所需蛋白质的氨基端。酶如C端水解酶将裂解融合蛋白中的遍在蛋白的C端，从而释放天然形式的所需蛋白以及生成游离遍在蛋白。所得融合蛋白中存在遍在蛋白基因导致基因表达增强，从而比在没有遍在蛋白基因的情况中产生更大量的所需蛋白质。必需使用的只是遍在蛋白基因的编码部分。遍在蛋白启动子是非必需的，且遍在蛋白基因融合体可在异源启动子的控制下。本专利技术的第二方面是将编码黄瓜花叶病毒外壳蛋白的14个氨基酸的核酸置于编码所需蛋白的基因的前本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加所需蛋白质在植物细胞或植物中的产量的方法，包括将第一个核酸插入第二个核酸的上游以形成融合核酸，其中所述第一个核酸编码遍在蛋白单体，所述第二个核酸编码所述所需的蛋白质，且所述融合核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白的表达不在遍在蛋白启动子的控制下。

【技术特征摘要】
范围内可对本发明加以修改。参考文献Baker RT，Smith SA，Marano R，McKee J，Board PG用共翻译融合体及遍在蛋白裂解进行蛋白质表达，人pi类谷胱甘肽S-转移酶的谷胱甘肽结合位点的诱变，J.Biol.Chem.26925381-25386(1994)。Barr PJ，Inselburg J，Green KM，Kansopon J，Hahm BK，Gibson HL，Lee-Ng CT，Bzik DJ，Li W，Bathurst IC重组恶性疟原虫SERA蛋白在啮齿类中的免疫原性，Mol.Biochem.Parasitol.45159-170(1991)。Butt TR，Jonnalagadda S，Monia BP，Stemberg EJ，Marsh JA，StadelJM，Ecker DJ，Crooke ST遍在蛋白融合增加克隆基因产物在大肠杆菌中的产量，美国科学院院报862540-2544(1989)。Coggan M，Baker R，Miloszewski K，Woodfield G，Board P导致凝结因子XIII亚单位A缺陷的突变在酵母中表达后突变蛋白的鉴定，Blood 92455-2460(1995)。Ecker DJ，Stadel JM，Butt TR，Marsh JA，Monia BP，Powers DA，Gorman JA，Clark PE，Warren F，Shatzman A，Crooker ST通过与遍在蛋白融合增加酵母中的基因表达，J.Biol.Chem.2647715-7719(1989)。Gali RR，Board PG人谷胱甘肽合成酶cDNA的测序和表达，Biochem J.310353-358(1995)。Garbarino JE，Belknap WR从马铃薯中分离遍在蛋白-核糖体蛋白基因(ubi3)及其启动子在转基因植物中的表达，Plant Mol.Biol.24119-127(1994)。Garbarino JE，Oosumi T，Belknap WR多遍在蛋白启动子的分离及其在转基因马铃薯植物中的表达，Plant Physiol.1091371-1378(1995)。Gehring MR，Condon B，Margosiak SA，Kan CC从大肠杆菌中纯化的Phe-81和Val-82人成纤维细胞胶原酶催化结构域的鉴定，J.Biol.Chem.27022507-225 13(1995).Genschik P，Marbach J，Uze M，Feuerman M，Plesse B，Fleck J烟草的应力和发育调控的多遍在蛋白编码基因的结构和启动子活性，Gene 148195-202(1994)。Guo DC，Qiao L，Fang RX，Mang KQ经PCR克隆黄瓜花叶病毒(SD株)的外壳蛋白基因，Acta Microbiologica Sinica 33233-235(1993)。Han K，Hong J，Lim HC，Kim CH，Park Y，Cho JM含有trp启动子和遍在蛋白序列的重组大肠杆菌中的酪氨酸酶生产，Ann.N.Y.Acad.Sci.72130-42(1994)。Kiefer MC，Schmid C，Waldvogel M，Schlapfer I，Futo E，MasiarzFR，Green K，Barr PJ，Zapf J在酵母中生产的重组人胰岛素样生长因子结合蛋白4，5和6的鉴定，J.Biol.Chem.26712692-12699(1992)。Lu C，Yang Y-F，Ohashi H，Walfish PG大鼠肝c-erbA β-类胸腺激素受体在酵母(酿酒酵母)中的体内表达，Biochem.Biophys.Res.Commun.171138-142(1990)。Lyttle CR，Damian-Matsumura P，Juul H，Butt TR在酵母模型系统中的人雌激素受体调节及受体兴奋剂和拮抗剂的研究，J.SteroidBiochem.Mol.Biol.42677-685(1992)。Mak P，McDonnell DP，Weigel NL，Schrader WT，O′malley BW有功能的鸡输卵管孕酮受体在酵母(酿酒酵母)中的表达，J.Biol.Chem.26421613-21618(1989).McDonnell DP，Pike JW，Drutz DJ，Butt TR，O′malley BW维生素D应答性骨钙蛋白转录单位在酿酒酵母中的重构，Mol.Cell.Biol.93517-3523(1989)。McDonnell DP，Nawaz Z，Densmore C，Weigel NL，Pham TA，ClarkJH，O′malley BW生物学活性雌激素受体在酿酒酵母中的高水平表达，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.39291-297(1991)。Pilon AL，Yost P，Chase TE，Lohnas GL，Bentley WE从大肠杆菌中高水平表达和有效回收遍在蛋白融合体，Biotechnol.Prog.12331-337(1996)。Poletti A，Weigel NL，McDonnell DP，Schrader WT，O′malley BW，Conneey OM用于在酿酒酵母中表达鸡孕酮受体cPRA的一种新的高度调控的快速诱导的系统，Gene 11451-58(1992)。Rian E，Jemtland R，Olstad OK，Gordeladze JO，Gautvik KM酿酒酵母中人副甲状腺素相关蛋白(1-141)的合成，对于该激素的生物活性非常重要的正确氨基端加工通过遍在蛋白融合蛋白途径获得，Eur.J.Biochem.213641-648(1993)。Sabin EA，Lee-Ng CT，Shuster JR，Barr PJ嵌合遍在蛋白融合蛋白在酿酒酵母中的高水平表达和体内加工，Bio/Technology 7705-709(1989)。Tan KL，Board PG重组人θ类谷胱甘肽转移酶(GSTT2-2)的纯化和鉴定，Biochem.J.315727-732(1996)。Welch AR，Holman C，Browner MF，Gehring MR，Kan CC，Van-Wart HE在大肠杆菌中生产的人matrilysin的纯化以及用一种新的优化的产生荧光的肽底物进行的鉴定，Arch.Biochem.Biophys.32459-64(1995)。美国专利5,093,242美国专利5,196,321美国专利5,496,721PCT公开号WO89/09829PCT公开号WO92/08795PCT公开号WO94/23040PCT公开号WO95/21269PCT公开号WO95/29195PCT公开号WO96/03519PCT公开号WO96/04377PCT公开号WO96/03522EP 608532序列表<110>Fang，Rong-XiangWu.Jun-LinChen，Xiao-Ying分子农业生物学院<120>经遍在蛋白或黄瓜花叶病毒外壳蛋白肽的N末端融合在高等植物中增加蛋白质生产<130>GM/AY/RN/R33-59<140>PCT/SG 98/00103<141>1998-12-11<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>235<212>DNA<213>Nicotiana tabacum<220><221>CDS<222>(3)..(230)<220><223>野生型经修饰而在包含起始密码子ATG的区域中插入一SphI位点并且在最后一个密码子GGC后插入一NcoI位点<400>1gc atg cag atc ttc gta aag acc ctg acg ggg aag act att acc tta 47Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu1 5 10 15gag gta gag tca tcg gac acc att gac aat gtt aag gct aag att cag 95Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln20 25 30gac aag gaa ggc att cca ccg gac cag cag cgg ttg att ttc gca ggt 143Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly35 40 45aag cag ctt gag gat ggc cga aca cta gct gac tac aac atc cag aag 191Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys50 55 60gag tcc act ctc cat ctc gtc tta aga ctc cgc ggt ggc catgg 235Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly65 70 75<210>2<211>76<212>PRT<213>Nicotiana tabacum<400>2Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile ...

【专利技术属性】
技术研发人员：方荣祥，吴俊林，陈晓英，
申请(专利权)人：分子农业生物学院，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]