一种制备用于生产头孢菌素抗菌素的重要中间产物：７－氨基去乙酸基头孢菌烷酸（７－ＡＤＣＡ）的新的生物方法。该方法包括在己二酸原粒存在下培养已转化的产黄青霉菌菌株从而生产己二酰－６－ＡＰＡ（６－氨基青霉菌烷酸）；以及用转化产黄青霉菌的来自，例如Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ的扩展酶基因在原位进行表达，将己二酰－６－ＡＰＡ进行环扩展使其转变为己二酰－７－ＡＤＣＡ。然后利用己二酰酰基转移酶裂解己二酰侧链而制备最终产物，７－ＡＤＣＡ。因此，整个合成过程是通过生物方法进行的，既高效又经济。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为1992年9月10日，申请号为92112278.0，专利技术名称为“制备7—ADCA的新的生物方法”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术属于制备商品头孢菌素抗菌素的合成方法领域，目前此类抗菌素已有很多，这些治疗剂是第四代产品。由于商品头孢霉素中存在大量的各种各样的侧链以及头孢菌素显著的经济上的重要性因而使得成功制备关键性中间产物的更经济，更有效的方法变得日益重要，这些中间产物便于头孢菌素的快速合成。这些关链的中间产物之一是7-氨基去乙酸基头孢菌烷酸(7-ADCA)，该物质用下面通式表示 目前，7-ADCA是从青霉素G中产生的，并且需要4或5个化学步骤以将青霉素环系从5员环扩展到代表头孢菌素特征的六员环。由于该方法是典型的全部化学合成过程，因而存在严重的缺陷。这些缺陷是该方法需要多个步骤，是一个复杂的过程，需要昂贵的试剂，产生很多副产物导致污物处理问题，以及需在化学处理开始前对高度不纯的起始材料加以纯化。因此，人们在不断探索研究一种微生物或发酵方法，通过酶促反应使环扩展以及切割侧链，从而以比目前使用的化学方法更经济地的方法提供7-ADCA。因此，具体地说，本专利技术涉及制备关键的头孢菌素中间产物7-ADCA，更具体地讲，本专利技术涉及制备7-ADCA的生物方法。已证明，到目前为止，在探索制备7-ADCA的成功的生物方法方面的研究都没有取得成效，肯定对一种工业生产规模而言确实如此。例如，利用直接的发酵法和/或通过酶促处理青霉素G时，可以制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)，仅再需产生7-ADCA所必需的环扩展步骤，不幸的是，已发现在这些微生物的正常代谢途经中进行环扩展的头孢子菌属或链霉菌属酶并不以6-APA作为底物。在本领域内将这些酶统称为DAOCS或扩展酶，定义为催化青霉素型分子中存在的Penam环结构扩展为Ceph-3-em环(如头孢菌素中存在的结构)的酶。下文中，将这些酶称为“扩展酶”。该扩展酶作用的底物是青霉素N，使其环扩展获得脱乙酸基头孢菌素C(DAOC)。这里，只需要切除(D)-a-氨基己二酰侧链以得到7-ADCA，但已证明该侧链对酶促切割具有顽强的抗性，仅能获得低得没什么价值的产量。按照本专利技术，可以获得一种有效的生物方法，其中利用新的发酵方法以高效价生产青霉素化合物(有一个己二酰侧链)，所说的青霉素化合物是一种可为扩展酶系接受的底物，该扩展酶系是由能产生青霉素化合物的同样的微生物原位产生的，该微生物已被转化并表达所说的扩展酶系。然后该扩展酶作用青霉素化合物进行环扩展产生高产量的头孢菌素化合物。并且重要的是在第二个关键步骤中，可通过另一酶系以惊人的高产量移去青霉素化合物(即眼下的一种头孢菌素化合物)的侧链。包含本专利技术的这种独特生物方法的意外结果是以惊人的高产量生产7-ADCA。在Curr.Genet.(1990)17213-221上Cantwell等人建议了一种通过对青霉素V进行环扩展，然后通过酶促水解得到的去乙酸基头孢菌素V而形成7-ADCA而制备7-ADCA的生物方法。该方案的根据是从S.clavuligerus可得到的一个克隆青霉素N扩展酶基因(cefE)(Kovacevic等人，J.Bacteriol.(1989)171754-760和U.S.5,070,020)。但是，由于该扩展酶作用于青霉素N，其天然底物，而不作用于青霉素V，该方案需要通过遗传工程操作而产生能扩展青霉素V环的经过修饰的扩展酶基因。然而Cantwell等人没有获得所需的修饰，他们仅成功地用Streptomyces Clavuligerus的cefE基因转化产黄青霉菌，并得到低水平表达DAOCS(扩展酶)酶。本领域内技术人员已对扩展酶，其活性和遗传序列进行了充分的研究。例如，在Wolfe的U.S.4,510,246和4,536,476中已从产生β-内酰胺的原核生物，包括Streptomyces clavuligerus，的无细胞抽提物中分别分离出环化酶，表异构酶和环扩展酶，从而提供稳定的酶试剂。EP-A-0366354描述了一种来自S.clavuligerus的离体纯化的扩展酶，并已对其进行过鉴定包括末端残基和氨基酸组成，据说其分子量约为34,600道尔顿。但是，与其相反，在U.S.4,536,476中确定同样的酶其分子量为29,000。在EP-A-0233715中公开了从S.Clavuligerus获得的扩展酶的分离和核酸内切酶限制性图谱特性，转化和在宿主中表达所说的酶，并证实用所说的酶进行青霉素N底物的环扩展。U.S.5,070,020公开了编码从S.Clavuligerus获得的扩展酶的DNA序列，并描述了用含有所说DNA序列的表达载体转化产黄青霉菌菌株的过程，从而获得扩展酶的表达。文献中暗示利用该酶可对除青霉素N以外的底物进行扩展，但事实上没有证明这种扩展法。上面描述的研究工作其注意力集中于来源于原核的S.Clavuligerus的扩展酶。利用真核的支顶头孢霉菌株(也称为产黄支顶孢菌)也可以表达同样的酶，或至少明显具有相同环扩展活性的酶。但是，在这种菌株中扩展酶活性是由双功能基因(cefEF)表达的，该基因也能表达出DACS(羟化酶)活性，该酶的天然功能是将扩展酶的去乙酸基头孢菌烷酸(DAOC)产物转变为脱乙酰基头孢菌素C(DAC)。该结果是单一的，但得到双功能扩展/羟化酶。在分离这两种基因产物的活性方面已作了许多工作，但至今没有成功。例如，EP-A-0281391公开了从支顶头孢菌STCC11550获得的DAOCS/DACS基因连同相应的酶的氨基酸序列的分离和DNA序列的鉴定，转化青霉菌并表达该酶，但是，从没有实现将青霉素G和V转变为相应的头孢菌素的企图。再者，尽管建议利用遗传工程技术可以提供快速的从DACS中分离编码DAOCS的遗传信息并分别表达这两种酶的方法，但没有提供已真正实现这种分离的证据。本领域内技术人员对支顶头孢菌的DAOCS/DACS(扩展酶/羟化酶)酶也进行了充分的研究，包括其活性及其特征和遗传序列。例如，在Demain的U.S.4,178,210；4,248,966；和4,307,192中，用能异构化和扩展环的支顶头孢菌无细胞抽提物处理各种青霉素型起始材料而得到头孢菌素抗菌素产物。Wu-Kuang Yeh在U.S.4,753,881中描述了支顶头孢菌酶的等电点，分子量，氨基残基，水解酶与扩展酶的活性比和肽片段各项指标。上面讨论的现有技术仅解决了本专利技术的一个方面，即用表达扩展酶的基因转化产黄青霉菌菌株，并实现该酶的表达。但是该方法仅使用表达的酶对青霉素N而不是对青霉素G和V进行环扩展。甚至于在这种情况下，如本专利技术所述青霉素N有一个7位侧链，不能用酶切割该侧链而得到7-ADCA。本专利技术是基于下述惊人发现，即利用产黄青霉素菌株可有效地增加己二酰侧链，该菌株原位产生的扩展酶可利用化合物有效地作为底物进行环扩展得己二酰7-ADCA，并且也可以利用另一种酶有效地移去己二酰侧链得到7-ADCA。虽然现有技术中已发现本专利技术的各种离体的片段，但并没有暗示将它们结合起来会产生本专利技术方法所获得的意外结果。例如，在本领域内生产6-己二酰青霉烷酸是已知的(见Ballio，A.等人，Nature(1960本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组ＤＮＡ表达载体，包括来源于Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ２７０６４的编码扩展酶的ＤＮＡ，以及一个启动编码所说的扩展酶的ＤＮＡ表达的启动子，所述启动子含有产黄青霉菌ＩＰＮＳ基因启动子。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：MJ康达，L克罗福，PC麦阿达，JA兰保塞克，
申请(专利权)人：DSM有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]
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