带内含子的卡那霉素抗性基因及其应用制造技术

利用ＰＣＲ方法，在卡那霉素抗性基因编码区Ｎ端１３位插入一个１８９ｂｐ植物内含子，合成带内含子的卡那霉素抗性基因。在转基因植物中，该基因不但可以用来替换卡那霉素抗性基因作为转化体抗性筛选，而且比卡那霉素抗性基因更具优点：（１）在转化过程中，不需加入其它抗生素即可完成植物转化体选择和杀灭农杆菌的双重目的，防止了其它抗生素对转化的影响，提高了转化效率。（２）该基因在原核细菌中没有活性，消除了抗性基因对环境的污染。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及植物转基因领域中筛选转化体用的抗生素抗性基因，尤其是关于带内含子的卡那霉素抗性基因及其应用。在高等植物外源基因导入过程中，以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转化已经成为主要的，行之有效的方法(Schell1987，Sci，2371176～1183)。根癌农杆菌转化包括细菌对植物叶片、叶柄等外植体的侵染；受侵外植体在含有抗生素的培养基中生长，并筛选具有抗性外植体；抗性外植体分化出抗性芽；在一定的激素调节下再生出抗性植株。为了防止农杆菌侵染后在外植体上过度生长，造成外植体死亡，常在筛选培养基加入羧苄青霉素或头胞霉素，用来杀死农杆菌细胞。羧苄青霉素和头胞霉素都能抑制根癌农杆菌的生长和繁殖，因此在根癌农杆菌介导的转基因过程中，常采用这两种抗生素来消除转化后的农杆菌。但是研究表明，这两种抗生素都有类似植物激素的活性(Okkels 1988，Acta Hort，225199～207；Mathias 1986，Plant Sci，46217～223)。头胞霉素对不同的植物组织具有很强的毒性(Pollock 1983，Plant Cell Rep，236～39)，而羧苄青霉素具有类似2，4-D的结构和功能(Holford 1992，Plant Cell Rep，1193～96)，当羧苄青霉素和2，4-D混加时，很容易导致外植体的坏死，而在拟南芥菜转化过程中，筛选培养基中加入羧苄青霉素500mg/L后，调节细胞分裂素与生长素的比例有利于外植体再生频率的提高，外植体再生频率提高后，很容易出现假的抗性芽，在以后分化、再生出植株的过程中，增加了转接和检测的工作量。另一方面，由于羧苄青霉素和头胞霉素类拟植物激素的活性，在受侵外植体的筛选过程中，加入这两种抗生素后，培养基中的激素变得非常复杂，各类激素的比例很难调节，从而影响转化体的再生，有的外植体再生频率大幅度下降，导致筛选不出转化体(Lin 1995，Plant Sci，109171～177)。如果能利用单一的抗生素作为抗性筛选可以减轻抗生素对转化的影响。在植物双元载体构建过程中，常常采用花椰菜花叶病毒35S启动子调控卡那霉素抗性基因的表达，并将这个表达单元和需要转化到植物的外源基因表达单元一起组装到整合区左右边界内，通过农杆菌共同整合到植物的染色体上，然后在植物细胞中表达，使转化成功的细胞具有卡那霉素抗性，因此，通过含有卡那霉素的培养基中培养植物的外植体可以筛选出转基因植株。然而，在根癌农杆菌中包括CaMV35S在内的多种启动子均具有一定活性(Vancanneyt 1990，Mol Gen Genet，220245～250)，以35S启动子和抗性基因相连，该抗性基因只能作为抗性植物的筛选标记，不能用一样的抗生素杀灭残存的农杆菌细胞，因此在抗性植株筛选过程中必须外加其他抗生素。另一个更为重要的因素是转基因植物中利用卡那霉素等抗生素作为筛选标记，对环境构成了很大的压力。科学家担心抗性基因可能通过微生物在自然界蔓延，很多人类的病原菌经过基因重组、交换和转移可以获得这些抗性基因，导致抗生素类药失去效果，最终威胁到人类自身健康。本专利技术的目的是为了克服羧苄青霉素和头胞霉素对受侵外植体再生的影响，减少卡那霉素抗性基因对环境造成的威胁，在农杆菌转化载体构建过程中，提供一种带内含子的卡那霉素抗性基因作为抗性选择标记，代替常用的卡那霉素抗性基因，用于植物转基因中筛选转基因植株。本专利技术提供带内含子的卡那霉素抗性基因，它是采取连续延伸PCR扩增的方法，将修饰突变的CAT-1基因第一内含子(Ohta 1990 Plant CellPhysiol，31(6)805～813)插入卡那霉素抗性基因编码区的N端序列的第13位。此内含子长189bp大小，在三个不同的开放阅读框架内都含有终止密码TAG(参见图2)。利用PCR方法从载体pCMBIA1201(Hajdulciewicz P.1994，Plant Molecular Biology 25(6)989-994)中扩增出内含子片段，PCR产物电泳并回收。以pBBR1MCR2(HevreroM.1990，Journal ofBacteriology 172(11)6557-6567)为模板扩增出约800bp的卡那霉素抗性基因，PCR产物电泳并回收。以两个PCR产物为模板，利用PCR方法将两个片段连接成带内含子的卡那霉素抗性基因，PCR合成过程示意图参见图1。得到的带内含子的卡那霉素抗性基因的DNA核苷酸序列见图3。将带内含子的卡那霉素抗性基因构建成植物双元表达载体pYP1202，通过农杆菌转化到植物中(见实施例3和4以烟草为例)利用不同浓度的卡那霉素和加有羧苄青霉素的培养基筛选转基因植物，检测带内含子的卡那霉素抗性基因对转化效率的影响。将构建好的植物双元表达载体pYP1202由35SΩ启动子控制，该抗性基因表达单元与GUS基因的表达单元连接在一起，位于转化区内，通过GUS基因的表达可以用来作为转基因成功与否的检测。本专利技术带内含子的卡那霉素抗性基因是利用原核生物缺少真核生物剪切加工的特点，在卡那霉素抗性基因编码区的N端加入一个内含子，在转基因植物中内含子能够正确剪切加工，使该基因产生有功能的蛋白，转基因外植体具有很高的卡那霉素抗性。当插入的内含子在不同的编码框里都有终止密码时，带内含子的抗性基因不能在农杆菌中表达出活性蛋白，低浓度的卡那霉素可以使细菌致死，因此在筛选培养基中加入卡那霉素后，转基因外植体能够生长而含有该基因的农杆菌不能生长。对于不同的转化材料，由于其本身对卡那霉素的耐受性有很大的差异，因此通过调节卡那霉素的浓度可以直接筛选转基因植株，从而避开了羧苄霉素和头胞霉素对转化的影响。此外，由于带内含子的卡那霉素抗性基因不能在细菌中正确编码，细菌不能表现卡那霉素抗性，转基因植物释放后，该基因不构成对环境的抗性选择压力，这样，大大增加了转基因植物的安全性。目前我们正利用该套体系进行大规模的植物基因转化工作，相继获得了苹果、康奈馨，小青菜，甘蓝和油菜等多种转基因植株。由于抗性筛选培养基中激素的可控性，使外植体再生频率能够调节到正常水平，因此对于一些再生频率较低的植物，该套体系的作用更加明显。本专利技术带内含子的卡那霉素抗性基因作为转基因植物的筛选标记具有如下优点(1)在植物转化过程中，只需在筛选培养基中加入卡那霉素即可以筛选转基因植物，不必利用羧苄青霉素和头胞霉素杀死农杆菌细胞。(2)和正常的卡那霉素抗性基因相比，带内含子的卡那霉素抗性基因可以提高转基因植物的卡那霉素抗性，因此利用该基因作为抗性筛选标记，在很高浓度的卡那霉素培养基中容易得到真正的转基因植物。(3)由于不受羧苄青霉素和头胞霉素的影响，被农杆菌侵染的植物外植体分化和再生条件容易控制，因此利用该基因作为选择标记，对一些再生特别困难的植物材料转化更加有利。(4)由于该基因在细菌中没有活性，不会在细菌中扩展蔓延，因此不象卡那霉素抗性基因，该基因对环境不构成污染，转基因植物具有安全性。本专利技术通过以下附图和实施例作进一步阐述，但不限制本专利技术的范围。 附图说明图1是带内含子卡那霉素抗性基因PCR合成过程示意图。图2是带内含子卡那霉素抗性基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种带内含子的卡那霉素抗性基因，其特征在于具有如下的ＤＮＡ核苷酸序列： １ ＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡ ＧＧＧＴＡＡＡＴＴＴ ＣＴＡＧＴＴＴＴＴＣ ＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴ ＴＣＴＴＧＧＴＴＡＧ ＧＡＣＣＣＴＴＴＴＣ ６１ ＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴ ＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴ ＴＴＧＡＴＣＴＴＴＣ ＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡ ＴＣＴＡＴＴＴＴＴＴ ＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧ １２１ ＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡ ＡＡＴＡＴＴＡＣＡＴ ＡＧＣＴＴＴＡＡＣＴ ＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡ ＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴ ＣＧＴＧＴＧＴＣＴＡ １８１ ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴ ＧＡＴＡＧＴＴＡＣＡ ＧＧＧＡＴＴＧＣＡＣ ＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣ ＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧ ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ ２４１ ＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴ ＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣ ＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡ ＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴ ＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣ ＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧ ３０１ ＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣ ＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣ ＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴ ＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧ ＡＣＣＴＧＴＣＣＧＧ ＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴ ３６１ ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧ ＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣ ＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧ ＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡ ＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴ ＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡ ４２１ ＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧ ＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣ ＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡ ＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣ ＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧ ＣＧＡＡＧＴＧＣＣＧ ４８１ ＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣ ＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣ ＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴ ＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡ ＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴ ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴ ５４１ ＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣ ＧＧＣＴＧＣＡＴＡＣ ＧＣＴＴＧＡＴＣＣＧ ＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣ ＣＡＴＡＣＧＡＣＣＡ ＣＣＡＡＧＣＧＡＡＡ ６０１ ＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧ ＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧ ＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧ ＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣ ＴＴＧＴＣＧＡＴＣＡ ＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧ ６６１ ＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ ＡＴＣＡＧＧＧＧＣＴ ＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣ ＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧ ＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡ ＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧ ７２１ ＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧ ＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴ ＣＧＴＧＡＣＣＣＡＴ ＧＧＣＧＡＴＧＣＣＴ ＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡ ＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧ ７８１ ＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣ ＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧ ＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣ ＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣ ＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣ ＧＧＡＣＣＧＣ...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚泉洪，彭日荷，熊爱生，
申请(专利权)人：上海市农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]