耐高温β-葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法技术

一种耐高温ＧＵＳ基因，是通过ＤＮＡ突变过程获得ＧＵＳ突变基因，再构建成表达载体，转化入大肠杆菌中，进行耐高温性筛选获得的耐８５℃的耐高温ＧＵＳ基因克隆，并对耐高温ＧＵＳ基因进行了序列测定，结果表明该耐高温ＧＵＳ基因具有１８１２个核苷酸。耐高温ＧＵＳ基因可简便地应用于转基因植物转化体的筛选，极大地提高转基因植株的检测效率，促进植物转基因研究的发展。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及植物转基因中转化体筛选时用的报告基因，尤其是关于耐高温GUS基因序列及其获得方法。在植物转基因中为了对转化材料进行筛选，标记基因和报告基因被逐渐选用。常用的报告基因是β-葡萄糖苷酸酶(bata-Glucuronidase，GUS)基因，绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因和冠瘿碱合成酶基因。1987年，Jefferson首次将GUS基因作为报告基因用于植物的遗传转化(JeffersonR A.，Mol Biol Rpt，1987，5387-405)。GUS的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)使表达GUS基因的细胞显示蓝色。Hü等(余叔文，汤章城，植物生理学与分子生物学，科学出版社，198856-58)测定了包括被子植物和裸子植物在内的52种植物的内源GUS活性，发现对于所测的多种植物在营养阶段并不存在GUS活性，但是在大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中却有明显的GUS活性，随着种子的萌发，GUS基因的活性逐渐消失，因此在利用GUS基因作为报告基因时可有针对性地排除来自植物的假阳性。但是由农杆菌介导的遗传转化，其必不可少的一步是对转化材料进行除菌，否则GUS能够在农杆菌中进行表达，而除菌不彻底时，GUS假阳性就不可避免。为了克服GUS基因的假阳性，Vancanneyt等(Vancanneyt G et al.，Mol Gen Genet，1990，220(2)245-250)根据真核生物具有原核生物不具有的内含子剪切特性的原理，向GUS基因中引入了一段植物内含子，在农杆菌中没有检测到明显的GUS活性。含有内含子的GUS基因就成为更加有效报告基因。但它还存在缺点因为大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中有明显的GUS活性，这就成为植物转基因检测的障碍，又因为在农杆菌侵染转化的过程中，由于农杆菌的除菌不彻底，GUS假阳性很严重。从而极大地限制了植物转基因研究的发展。另外，底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)的价格一直居高不下，因为假阳性和本底的存在，必须加大底物的用量，从而又导致了转化成本的上升。DNA突变(Shuffling)的含义为在与基因相关的DNA片段群体中，由于大量的随机片段相互参入而导致的重组或突变。随着PCR技术的发展和成熟，DNA Shuffling技术越来越成熟，应用越来越广泛，Stemmer在“DNAShuffling通过随机片段的重组，在体外导致分子进化”一文中具体阐述了DNA Shuffling的成熟技术路线，(Stemmer W P.，Proc natl Acad Sci，1994，91(22)10747-10751)，一基因经过DNA酶处理变成10到50bp的DNA随机短片段，然后经过两步PCR过程重新得到原来大小和有功能的基因，在重新获得基因过程中，产生大量的突变。从而称之为分子进化(Molecularevolution)。他还采用DNA Shuffling方法在很小的一个基因库中获得了β-内酰胺酶(β-lactamase)的一个突变基因，该基因的表达产量达640μg/ml，是当时任何报道最高水平的32000倍。Patel等(Patel R S.et al.，EMBO J，1987，6(9)2565-2572)在鼠纤连蛋白基因(rat fibronectin gene)编码的两个亚单元的纤连蛋白研究中，通过Shuffling的方法获得了一些新性状基因，其突变在基因中，甚至在启动子区域中也有较大的突变。GUS组织化学染色法由于其严重的假阳性，又因为底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄苷酸脂(X-Gluc)的价格居高不下，从而严重地限制了植物转基因的发展，寻找和发掘新的更好、更快、更准确、更价廉物美的报告基因及其获得的方法愈显迫切。在获得新的报告基因工作的探索中，将上述基因突变技术应用于GUS基因的突变是一个很有意义的工作。为此，本专利技术目的是提供一个新的报告基因——耐高温GUS基因，本专利技术另一目的是提供通过DNA突变及耐高温性筛选获得耐高温GUS基因的方法。本专利技术提供一种耐高温GUS基因，该基因获得方法包括下列步骤(1)、通过DNA突变过程，包括GUS基因PCR扩增；GUS基因PCR产物用DNA酶降解得小片段；小片段进行无引物PCR扩增及取无引物PCR产物加入引物PCR扩增四步，获得GUS基因突变体。(2)、将GUS突变基因构建成表达载体，经过耐高温性筛选，获得一个耐高温达85℃的耐高温GUS基因，并对耐高温GUS基因进行基因测序得到基因序列。 本
技术实现思路
详细叙述如下1、GUS基因的扩增与DNA突变过程根据(Clontech Laboratories，Inc.，GUS Gene Fusion System，PT1270-1Catalog#k1050-1)公布的GUS基因序列(见图1)，合成二个寡核苷酸引物，以质粒pBI121(从Clontech公司购得)——含有GUS基因的DNA为模板，扩增出PCR产物1.86kb的GUS基因片段，电泳结果见图2。回收的GUS基因片段以DNA酶进行降解，回收得小片段，电泳结果见图3，图3显示原来1.86kb条带降解为一片弥散的片段，透吸袋回收10-50bp的小片段，进行无引物PCR，扩增后产物电泳显示扩增片段为200-500bp的弥散条带，结果见图4。取无引物PCR产物加入引物进行PCR扩增，扩增后产物电泳显示扩增出单一的1.86kb基因片段，即为DNA突变后的GUS突变基因，电泳结果见图5。2、GUS突变基因的原核表达载体的构建与耐高温性筛选回收的GUS突变基因片段经BamHI和SacI双酶切后，与原核表达质粒pYP200P(上海农科院生物中心植物基因工程研究室构建)构建成表达载体pYP200hGUS(构建过程见图6)。电击法转化入大肠杆菌菌株DH5α中，进行耐高温性的筛选。DH5α空菌株和含GUS基因的菌株在70℃处理15分钟后X-gluc染色，检测不到蓝色。而对突变后GUS基因转化子进行大规模的耐高温性筛选，首先得到了一个耐80℃高温30分钟的阳性克隆。以此为材料进行第二轮的DNA突变，从大量的转化子(约108)中再次筛选到一些耐高温达85℃的阳性克隆。将这些阳性克隆化学法转入大肠杆菌菌株DH5α中，进行再次鉴定，得到一些性状稳定的耐高温GUS基因克隆。3、耐高温GUS基因的测序分析及蛋白质比较将性状稳定的耐高温GUS阳性克隆抽提质粒，进行GUS基因的全序列测定。共合成四条测序引物，经四次测序反应得到耐高温GUS基因的全长序列(序列见图8)。PC-GENE分析软件分析结果发现耐高温GUS基因序列同GUS基因相比同源性为99.2％，即1812个核苷酸中有11个位点发生了变化(见图9)。蛋白质分析发现，因为存在DNA遗传密码的简并性，其氨基酸序列的变化共有4个位点(见图10)，由于上述4个氨基酸的差异导致了耐高温GUS基因耐高温性的获得。将耐高温GUS基因构建成表达载体，利用根癌农杆菌将外源基因与耐高温GUS基因一起对植物进行耐高温基因转化，获得在高温下染色显示阳性的转基因植株，这样耐高温GUS基因就可简便地应用于转基因植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐高温ＧＵＳ基因，其特征在于具有如下的ＤＮＡ核苷酸序列及所编码的氨基酸序列： １０ ２０ ３０ ４０ ＡＴＧ ＴＴＡ ＣＧＴ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＣＣＡ ＡＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＴＣ ＭＥＴ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＧＣ ＧＡＡ ＡＡＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＴＴ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ １００ １１０ １２０ １３０ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＧＴ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＣ ＧＣＧ ＴＴＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＴＴ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｉｌｅ １４０ １５０ １６０ １７０ １８０ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＧＴ ＴＴＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＴＴＣ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＡＴＴ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ １９０ ２００ ２１０ ２２０ ＣＧＴ ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ ＧＡＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＴＡ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ ２３０ ２４０ ２５０ ２６０ ２７０ ＣＣＧ ＡＡＡ ＧＧＴ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＣＧ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ ２８０ ２９０ ３００ ３１０ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＧＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＴＧ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ ＭＥＴ ３２０ ３...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚泉洪，熊爱生，彭日荷，
申请(专利权)人：上海市农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]