高肝素结合力的多肽变异体制造技术

本发明专利技术涉及具有高肝素结合力的多肽变异体。它是通过将一氨基酸序列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（序列表中序列１或２）增加、插入和／或替代到原多肽中得到的。本发明专利技术提供的多肽变异体适用于刺激软骨生成、骨生成和伤口愈合。本发明专利技术也涉及编码所说的多肽变异体的氨基酸分子，包含所说的核酸分子的宿主细胞以及制备多肽变异体的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽变异体，它能增强与肝素的结合力。此外，它也与编码这些变异体的核酸分子，包含有这些核酸分子的宿主细胞，以及制备多肽变异体和重组的多肽变异体的方法有关。同时，本专利技术也涉及运用这些多肽变异体刺激软骨生成、骨生成、伤口愈合，治疗炎症和肿瘤。另外，该专利技术还涉及包含这些变异体的诱导骨生成的药物组合物。许多生物学因子影响人和动物的细胞、组织和器官的生长和再生。迄今，人们对其中许多因子知之甚少，对其调控过程不甚了解。骨生成过程就是其中一例，它可被区分成为数个连续的单个过程，如趋化、有丝分裂和分化过程等。趋化在这里是指主要包含不溶性的I型胶原在内的不溶性的脱矿物质的骨基质释放的信号连接产生的化学梯度引起细胞的直接迁移。不溶性的I型胶原可与血浆纤维结合蛋白结合，后者结构中有与胶原，纤维蛋白和肝素结合的部位。骨生成的调控主要包括两组生物学活性因子，即全身性活性因子和局部性活性因子。全身性活性因子包括PTH(甲状旁腺素)和1、25-二羟维生素D3。两者可调节内源性钙浓度。此外降钙素也参与成骨过程，它可抑制骨吸收。雌激素、雄激素、生长激素、胰岛素样生长因子(IGF)、甲状腺素和糖皮质激素均为全身性活性因子，参与成骨过程。局部活性因子包括(1)影响骨分解的细胞因子有IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6、IL-11和ODF(破骨分化因子，TRANCE)；(2)抑制骨分解的细胞因子有IL-4、IL-13、IL-18、OPG(OSTEOPROTEGERIN)、IFN(干扰素)和IL-1ra(白介素-1受体拮抗剂)(3)集落刺激因子M-CSF(巨噬系集落刺激因子)和GM-CSF(粒巨集落刺激因子)；(4)前列腺素、白三烯和一氧化氮；(5)生长因子IGF(胰岛素样生长因子)，decapentaplegic-Vg-related(DVR)家族中的蛋白，包括TGF-β(转化生长因子β)超家族蛋白，其包括活化/抑制剂家族的各种蛋白、MIS(苗勒抑制底物)、GDF(生长/分化因子)、nodal和dorsalin；FGF(纤维母细胞生长因子)，PDGF(血小板衍化生长因子)，和PTHrP(PTH相关蛋白或者甲状旁腺素相关蛋白)在本专利技术中，TGF-β超家族非常重要。到目前为止，各种生物体中除尚未得到公认的Orthologs外，TGF-β超家族包括20余种蛋白质，除TGF-βs外，还包括BMPs(骨形态生成蛋白)，GDFs(生长分化因子)的抑制素/活化素以及其它蛋白(Kingsley，1994)均由两个亚单位构成。这两个亚单位是由两个完全相同的单体形成的同源二聚体，由一个二硫共价键相连。迄今发现TGF-β超家族蛋白结构中的一个显著特点是存在″TGF-β/BMP结构″，它包含一个半胱氨酸结，一个α螺旋，每个单体至少有4股β链，在二聚体中构成一个单体独特的结构(MC Donald andHendrickson，1993)。氨基酸序列显著不同，有时有最高可达40％的同源率。袢区和N端序列变化较大，虽然如此，在进化过程中，TGF-β超家族的所有成员的结构和功能仍显示出令人惊讶的保守程度。它们均含有一个结构要素称作″半胱氨酸结″，它由3个二硫共价健形成三环结构域，在所有TGF-β超家族蛋白中此种结构得以保留并完全相同。除TGF-βs外，其它被深入研究的代表系BMPs中的成员，如BMP-2和BMP-7，以及GDFs成员中的GDF-5，它们均可影响骨和软骨的发育和再生。如BMP-2在异位或常位植入中均显示诱导骨生成的特性。TGF-β超家族的蛋白质在细胞内合成，由较大的蛋白前体水解后形成成熟的蛋白。通过对蛋白前体Arg××Arg序列的识别切除，释放出C端大约100到140个氨基酸残基序列，就是所谓的成熟蛋白。在信号传导方面，TGF-β超家族中的细胞因子与两种靶细胞膜受体的胞外肽段结合，即可诱导的骨髓干细胞。2型亚单位胞内肽段内包含一个蛋白丝氨酸激酶，在与I型亚单位中的配体结合时可磷酸化丝氨酸残基，同时它也激活1型亚单位内的一个丝氨酸蛋白激酶，后者可磷酸化和激活胞内信号蛋白如SMADS。有证据提示1、2型亚单位均以二聚体形式存在。最近，激活素受体2型亚单位(Act-RII)的胞外段功能域晶体状结构已得到确认。BMP-2作为TGF-β家族中研究得最深入的蛋白，它通过半胱氨酸结中的第一个半胱氨酸下游的高度保守区域与受体亚单位结合。BMP-2中半胱氨酸结的第一个胱氨酸上游的高度变异的N端序列并不直接与受体亚单位起反应。TGF-β超家族的蛋白与1、2型受体亚单位的相互作用在一定程度上是随机的，缺乏特异性。目前对受体亚单位的通用程度或受体活化机理差异的程度研究均不明了，特别是目前文献尚未揭示究竟是此蛋白质的哪个结构域决定其特异性功能，如促骨生成活性。除受体亚单位外，TGF-β超家族成员还可与其它一系列蛋白相互作用来调节或抑制自身活性。Fetuin/α 2-HS糖蛋白和其衍生的多肽(TRH1)可与BMP-2和TGF-β结合，而与BMP-2的结合力更高，它可与受体竞争结合。哺乳类头蛋白(NOGGIN PROTEIN)与受体竞争结合BMP-2，而它的结合力更高。有爪蟾蜍卵母细胞显示Chordin是BMP-4的抑制剂。Follistatin与激活素有高结合力，而BMP-7和BMP-2被证明可与肝素结合。鉴于其生理学特性，TGF-β超家族成员显然在治疗运用中很有潜力可挖，特别是那些重组蛋白，因为它们可大批量生产，而且，编码它的核酸在基因治疗中也是一项有力工具。因此，所有TGF-β超家族成员及其生物学特性改变的变异体引起了人们的普遍重视。Kubleret等(1999)描述了一个BMP的类似物EHBMP-2的一级结构，它与人类天然BMP-2的差异在于BMP-2的头12个氨基酸被人类IL-2的头13个氨基酸序列取代，而被取代的部位正是BMP-2与肝素的高亲和部位。这种基因突变的BMP-2类似物在大肠杆菌中重组并表达。例如体外研究发现，EHBMP-2在不同细胞培养中显示出极低的肝素结合力和高度生物学活性。变异体的体内活性与天然BMP-2相比，在老鼠体内4μM浓度的BMP-2可使所用样本产生异位骨诱导生成，而EHBMP-2浓度须达到40μM才能产生同样效果。此外，在同样蛋白浓度条件下，BMP-2诱导的新骨生成的最终程度显著地高于EHBMP-2。本专利技术的目的在于提供在体内与野生型相同或更有效的多肽变异体。进一步的目标在于提供编码这些多肽变异体的核酸，以及含有这些核酸的载体和宿主细胞，更进一步的目标是提供制备多肽的方法。最后还可提供包含这些多肽变异体的药物组合物并在临床运用。根据本专利技术，我们将通过构造一个高肝素结合力的多肽变异体来达到目的，具体描述如下<1>将至少一个包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽加在低肝素结合力的多肽氨基酸序列中；和/或<2>将至少一个包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽插入一个多肽的氨基酸序列中；和/或<3>用一个包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽替换多肽的氨基酸序列中至少一个天然存在的寡肽序列其中X1＝K，R或H；X2＝K，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有高肝素结合力的多肽变异体，其特征在于： 〈１〉将至少一个包含氨基酸序列Ｘ↓［１］Ｘ↓［２］Ｘ↓［３］Ｘ↓［４］Ｘ↓［５］Ｘ↓［６］的寡肽加在低肝素结合力的多肽氨基酸序列中；和／或 〈２〉将至少一个包含氨基酸序列Ｘ↓［１］Ｘ↓［２］Ｘ↓［３］Ｘ↓［４］Ｘ↓［５］Ｘ↓［６］的寡肽插入一个多肽的氨基酸序列中；和／或 〈３〉用一个包含氨基酸序列Ｘ↓［１］Ｘ↓［２］Ｘ↓［３］Ｘ↓［４］Ｘ↓［５］Ｘ↓［６］的寡肽替换多肽的氨基酸序列中至少一个天然存在的寡肽序列 其中： Ｘ１＝Ｋ，Ｒ或Ｈ； Ｘ２＝Ｋ，Ｒｏｒ或Ｈ； Ｘ３＝Ｋ，Ｒ，Ｈ或无氨基酸； Ｘ４＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸 Ｘ５＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸，或无氨基酸 Ｘ６＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸，或无氨基酸（序列表中序列：１） 或者： Ｘ１＝Ｋ，Ｒ或Ｈ； Ｘ２＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸 Ｘ３＝Ｋ，Ｒ或Ｈ； Ｘ４＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸 Ｘ５＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸或无氨基酸 Ｘ６＝非Ｋ，Ｒ，Ｈ的其它任何氨基酸或无氨基酸（序列表中序列：２）。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：瓦尔特西巴特，
申请(专利权)人：东方基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]