疟疾疫苗制造技术

本发明专利技术涉及针对疟疾的疫苗，该疫苗包含具有疟原虫属的物种环子孢子蛋白Ｃ端部分的氨基酸序列的多肽，其中多肽的一对或多对半胱氨酸残基被氧化，且任选地含有用于人类的合适载体和／或佐剂和／或生物可降解微囊。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及针对疟疾的疫苗。本专利技术还涉及能够在受试者体内引发针对疟疾的免疫学和保护性应答的多肽，及其在预防中的用途。疟疾是受感染蚊子在吸血过程中将子孢子接种到哺乳动物宿主体内从而得到传播的寄生虫病。几分钟内，子孢子就侵入肝细胞，并在细胞内通过无性裂殖发育成裂殖子。然后裂殖子侵入红细胞，产生与疾病有关的各种症状。当配子体在蚊子(传病媒介)吸血过程中被摄取时，即完成了生活周期。通过用辐照减毒的子孢子免疫小鼠和人，可以获得针对疟疾的保护性免疫。该免疫力是中和抗体识别血流中游离子孢子及CD4+和CD8+T细胞阻止寄生虫肝形式发展的作用结果。在B细胞缺陷小鼠中进行的实验证明，尽管存在抗子孢子抗体，保护作用由经辐照的子孢子免疫诱导。这说明在肝细胞内阶段存在的蛋白质特异性T细胞在保护中发挥重要作用。因此，疟疾疫苗研究的目的之一是模拟由注射经辐照子孢子诱导的保护性免疫应答。在得出本专利技术的研究中发现，使用固相肽合成法产生的、包含伯格氏鼠疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子蛋白C端区域69个氨基酸(PbCS 242-310)的多肽，在存在不完全弗氏佐剂(IFA)的条件下，尾基皮下注射2次后，在BALB/c小鼠(H-2d)中引发(i)高滴度的抗肽抗体，该抗体还识别天然的伯格氏鼠疟原虫CS蛋白，(ii)针对主要组织相容性复合物(MHC)抗原Kd限制性肽PbCS 245-253特异的溶细胞性T细胞，和(iii)针对子孢子诱导的疟疾的部分CD8+依赖性的保护作用。通过IFN-γ ELISPOT，在用短的最佳CTL肽245-253或多肽242-310免疫的动物的引流淋巴结中，发现了相同频率的肽PbCS 245-253特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，说明较长的多肽在MHCI型而言的体内加工及呈递正如短的CTL肽一样有效。有趣的是，当C端肽中存在的4个半胱氨酸残基被完全氧化后，观察到甚至更高水平的CTL活性和保护作用。这些发现指出了C端片段的化学本性对于激活免疫系统及伴随的保护作用的潜在重要性。更一般而言，由于免疫系统的多个方面受到长的合成多肽的刺激，这些可能为用重组蛋白质片段或短肽进行疫苗接种提供有价值的选项。根据这个发现，本专利技术提供了针对疟疾的疫苗(特别是用于人类)，该疫苗包括具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽至少包含4个末端半胱氨酸，其中至少一对被氧化，该疫苗任选的还包括合适载体和/或佐剂和/或生物可降解微囊。生物可降解微囊是大约1-10μm的球体，和用于本专利技术疫苗的非常合适的载体和/或佐剂。具体而言，本专利技术的疫苗是基于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)环子孢子蛋白，更具体而言，是恶性疟原虫NF54株。优选疫苗中的多肽由衍生自环子孢子蛋白C端部分的至少42个连续氨基酸组成。更特别的，本专利技术所涉及疫苗中的多肽至少包含恶性疟原虫的第342-383位氨基酸，甚至更特别的，至少包含恶性疟原虫NF54株的第342-383位氨基酸。优选由恶性疟原虫环子孢子蛋白C端部分衍生的多肽中存在的所有4个半胱氨酸都被氧化。发现当佐剂是MontanideTM时本专利技术的疫苗特别有用。MontanidTMISA佐剂(Seppic，巴黎，法国；ISA＝不完全Seppic佐剂)是一组基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢矿物油和可代谢矿物油之一或二者混和物组合。将它们与水性抗原溶液制备成乳剂以供使用。各种Montanide ISA佐剂组以油包水乳剂、水包油乳剂、或水包油包水乳剂使用。由于表面活性剂与油组合的多样性，不同的佐剂采用不同的水相/油相比率。这些佐剂的性能据说与用于抗体生成的不完全弗氏佐剂(IFA)相似；然而炎症应答通常较小。本专利技术还涉及具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽包含至少42个连续C端氨基酸，其中一对或多对半胱氨酸被氧化。在本专利技术的特定实施方案中，多肽包含恶性疟原虫NF54株的第342-383位氨基酸。优选多肽中存在的所有半胱氨酸残基都被氧化。此外，本专利技术涉及在针对疟疾的疫苗中使用的这种多肽，以及这种多肽用于制备针对疟疾的疫苗的用途。本专利技术将在下文实施例中进一步阐明，这些实施例绝非意欲限制本专利技术。在实施例中，参考了所示附图附图说明图1由用50μg肽PbCS 242-310(溶于IFA)免疫2次的小鼠的脾获得的CTL大量培养物的特异性。在标准铬释放测定法中，当靶细胞单独存在(空心符号)或用相应肽脉冲(实心符号)时，用所示肽体外刺激7天后测定特异性。图2由用肽PbCS 242-310(溶于IFA)免疫2次的小鼠分离的脾细胞的CTL大量培养物的特异性。在标准铬释放测定法中，用Kd、Dd、或Ld转染和用特异肽脉冲L细胞，用所示肽体外刺激7天后评定特异性。图3淋巴结(LN)细胞中肽PbCS 245-253特异性T细胞的测定(通过IFN-γ ELISPOT)。在第0天和3-4周后用各种抗原制剂(溶于IFA)尾基免疫小鼠。图A显示了肽PbCS 242-310或肽P30/PbCS 245-253；图B显示了还原态或氧化态PbCS 242-310。第二次注射后10-20天摘除每组2只小鼠的腹股沟和主动脉周围引流淋巴结，合并获得的细胞。在存在用或未用肽PbCS 245-253脉冲的经照射P815细胞的条件下，通过ELISPOT直接评定特异性T细胞的存在。只用IFA免疫的小鼠作为对照。结果代表了进行的3次实验；当将细胞与或不与PbCS肽245-252一起温育时，结果表述为获得的斑点的差异。图4第一次免疫后1个月评价的PfCS 282-383特异性抗体。如图2所示，通过ELISA评价了在存在MontanideTMISA-720(上图)或Alum(下图)的条件下、以2种肽剂量(100或300μg，分别用实心和空心符号表示)免疫的志愿者体内PfCS 282-383特异性抗体的存在。图5在存在MontanideTMISA-720的条件下、用100μg肽免疫的志愿者体内应答PfCS 282-383的淋巴细胞增殖的发展。在含各种浓度(30-0.04μg/ml)的PfCS 282-383的6天培养物中，测试了4名志愿者(编号1、4、6、和11)免疫前(第0月)和免疫后(第1-8月)的外周血淋巴细胞(PBL)。数据显示为5个复份培养物的最高平均刺激指数(S.I.)。对照培养物(TT和PHA)给出了满意的S.I.。箭头指示注射时间。*未测试。实施例9-mer肽PbCS 245-253对应于经鉴定的CTL表位(Romero等人，自然(Nature)341323-326，1989)。覆盖伯格氏鼠疟原虫ANKA株(Lanar，分子和生化寄生虫学(Mol.Bioch.Paras.)39151-153，1990)环子孢子蛋白C端区域的多肽PbCS 242-310如先前关于恶性疟原虫类似物的详细描述(Roggero等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)321301-1309，1995)获得。简而言之，在对-烷氧基苯甲醇树脂(Wang树脂)上制备多肽，取代程度为0.4mmol/g。使用10倍过量的F-moc氨基酸衍生物和30分钟的偶联时间。通过大小排阻层析(本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对疟疾的疫苗，其特别是用于人类，该疫苗包含具有疟原虫属的种环子孢子蛋白Ｃ端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽至少包含４个末端半胱氨酸，其中至少一对被氧化，该疫苗任选的还包含合适载体和／或佐剂和／或生物可降解微囊。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G科拉迪恩，M罗杰罗，
申请(专利权)人：RMF迪克塔吉恩有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]