一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系及其制备方法，以间充质干细胞(MSCs)为载体，通过层层自组装技术，在细胞表面逐层包裹负载了血管内皮生长因子(VEGF)的明胶和海藻酸盐，从而形成自组装载药缓释体系。本发明专利技术的自组装载药缓释体系具有良好的生物相容性和明显的生物学功能。由其制备的VEGF包封MSCs缓释体系能有效迁移至心肌梗死区域，并缓释VEGF，从而增强心肌功能，灌注梗死区域并促进血管再生，这有可能成为一种心肌梗死的有效的微创治疗方法。可以将MSCs更换为其它细胞作为载体，将VEGF更换为其它负载药物，从而实现向其它疾病病变区域的迁移和治疗，这在多种重大疾病的临床治疗中具有良好的应用前景。

A VEGF sustained-release system and its preparation method using mesenchymal stem cells as a carrier through layer self assembly load and its preparation method

The invention discloses a mesenchymal stem cells by self-assembly VEGF loaded sustained-release system and preparation method thereof as a carrier to mesenchymal stem cells (MSCs) as the carrier, by self-assembly technique, layer by layer wrapped on the surface of cells loaded with vascular endothelial growth factor (VEGF) and alginate gelatin salt, resulting in the formation of self assembly drug delivery system. The self - group loading drug sustained-release system of the invention has good biocompatibility and obvious biological function. The VEGF encapsulated MSCs delivery system prepared by this method can migrate effectively to the myocardial infarction area and slow down VEGF, thereby enhancing myocardial function, perfusion infarct area and promoting angiogenesis, which may become an effective minimally invasive treatment for myocardial infarction. MSCs can be replaced by other cells as a carrier, replacing VEGF into other load drugs, so as to achieve migration and treatment to other diseases, which has good application prospects in the clinical treatment of many major diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系及其制备方法
本专利技术涉及一种以间充质干细胞(MSCs)为载体通过层层自组装技术负载VEGF缓释体系及其制备方法，属于生物医药领域。
技术介绍
随着胶体晶体研究的火热，人们发现了一种不借助外力就能完成组装和构筑结构的方法—自组装技术，由于这种方法简便、结构多样、重复性好等优点，他已在物理、化学、生物、材料、医学等领域获得很大运用，而且越来越受到重视。多层载药体系是近年来生物医药研究的热点，它不同于普通的单层载药体系，具有载药种类多、突释率低、缓释效果好等优点。其中应用最广泛的为层层自组装技术(LbL)，是基于聚电解质阴阳离子所带正负电荷间相互作用的一种自组装超分子技术。由于其具有简单、快速、高效，制备条件温和、负载药物种类及方式多样、负载量可控、智能响应释放药物等优点，成为目前构建多层药物控释体系的重要方法。而凝胶是一种具有三维网络结构的高分子材料。因其具有粘弹性、高含水性和环境响应性等特性。因此，凝胶常被用来作为层层自组装的表面材料，在药物缓释以及生物传感等方面发挥着重要作用。大部分生长因子类药物由于不具有靶向性以及生物稳定性差，体内半衰期短，因此无法达到局部持久、稳定的效应浓度。如血管内皮生长因子(VEGF)，它是最重要的血管生成的因子。VEGF可以通过结合高亲和力受体包括高亲和性受体酪氨酸激酶受体Flk-1和酪氨酸激酶受体Fit-1来刺激内皮细胞增殖从而促进血管生成，并且它主要在内皮细胞中表达。VEGF可以用于心肌梗死后对心脏功能的改善，但直接静脉注射VEGF对心脏微血管的重建和增强心脏功能只有轻微影响，部分原因是由于血液中VEGF的半衰期很短(约几分钟)，到达病变部位后就失去了产生稳定效应的浓度。增加VEGF的剂量确实能够增加对目标组织的治疗效果，然而这会增加其它疾病发生的风险，如肿瘤，糖尿病视网膜病变，类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。因此，药物靶向递送和药物缓释成为了解决上述问题的关键。研究发现，组织病变会引起一些细胞向组织病变部位迁移。例如，急性心肌梗死引起的无菌炎症，就可以招募MSCs细胞到心肌梗死区域。SDF-1/CXCR4对受损心脏中MSCs的趋化、归巢和移植起着非常重要的作用。SDF-1被细胞分泌在缺血心肌部位和控制MSC招募。MSCs通过表面的CXCR4结合SDF-1从而沿着SDF-1的浓度梯度迁移至心肌梗死组织。因为MSCs来自于血液，因此具有良好的生物相容性。
技术实现思路
基于以上研究，为了解决传统载药体系存在的不足，实现药物的缓释和靶向运输，在保证疗效的前提下减少给药剂量，降低药物毒性。我们利用凝胶具有吸附和缓释效果，将药物吸附于凝胶，通过层层自组装技术将凝胶包裹在具有趋化功能的细胞表面，从而制备出一种新型的，具有良好生物相容性和生物学功能的载药体系，最终实现药物的缓释和靶向运输。为了实现上述目的本专利技术采用的技术方案是：一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系由以下制备方法获得：(1)分离并培养具有趋化功能的细胞；(2)制备层层自组装负载生长因子缓释体系；①将步骤(1)获得的具有趋化功能的细胞置于15mL的离心管中离心，去除上清液；②在离心管中加入负载了生长因子的明胶溶液，将离心管置于37℃条件下震荡孵育5～10分钟，然后在2000rpm条件下离心5分钟，去除上清液，用PBS进行清洗，再次离心并去上清液。③在离心管中加入负载了生长因子的海藻酸盐溶液，将离心管置于37℃下震荡孵育5～10分钟，2000rpm条件下离心5分钟，去除上清液，用PBS进行清洗，再次离心并去上清液；④重复所述步骤②、③过程几次便获得具有层层自组装结构的具有趋化功能的细胞负载生长因子缓释体系。所述具有趋化功能的细胞选自间充质干细胞、单核细胞和其祖细胞及由其分化而得的细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、纤维母细胞、上皮细胞、成肌细胞、肌腱细胞、单核造血干细胞和其祖细胞以及由其分化而得的细胞、免疫细胞、多核细胞、巨细胞、巨噬细胞和破骨细胞。所述生长因子选自血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转移生长因子(TGF)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素、神经生长因子(NGF)以及红细胞生成素。上述分离并培养所述间充质干细胞的步骤包括：1)取健康的SD大鼠，断颈处死后置于超净工作台，酒精浸泡清洗，解剖暴露出骨髓腔；2)用含有肝素的完全培养基反复冲洗骨髓腔，并收集骨髓细胞悬浮液，将悬浮液贴壁加入MSC生长培养基中进行培养；3)待原代细胞生长接近铺满瓶底80％时，进行传代培养。所述MSC生长培养基为含有10％的FBS和抗生素的α-MEM培养基，所用的培养方法为全骨髓贴壁法，培养条件为置于37℃,5％CO2,95％饱和湿度培养箱中培养。所述负载了VEGF的明胶溶液的用量为5～10mL，制备方法是将5～15μg的VEGF与0.05％～0.1％明胶溶液进行混合，使VEGF吸附在明胶中；所述负载了VEGF的海藻酸盐溶液的用量为5～10mL，制备方法是将5～15μg的VEGF与0.05％～0.1％海藻酸盐溶液进行混合，使VEGF吸附在海藻酸盐中。本专利技术的自组装载药缓释体系具有良好的生物相容性和明显的生物学功能。由其制备的VEGF包封MSCs缓释体系能有效迁移至心肌梗死区域，并缓释VEGF，从而增强心肌功能，灌注梗死区域并促进血管再生，这有可能成为一种心肌梗死的有效的微创治疗方法。可以将MSCs更换为其它细胞作为载体，将VEGF更换为其它负载药物，从而实现向其它疾病病变区域的迁移和治疗，这在多种重大疾病的临床治疗中具有良好的应用前景。附图说明图1为LbL-MSCs和MSCs的透射电镜图。图中a.LbL-MSCs不同放大倍数的透射电镜图；图中b.MSCs不同放大倍数的透射电镜图。图中箭头所指表示MSCs表面的层层自组装薄层。图2为LbL-MSCs中VEGF检测图及电位分析图。其中a,b,c分别表示LbL-MSCs组的anti-VEGF染色图、DAPI染色图、merge图；d,e,f分别表示Control-MSCs组的anti-VEGF染色图、DAPI染色图、merge图；g,h,i分别表示MSCs组的anti-VEGF染色图、DAPI染色图、merge图；图中j表示MSCs表面的电位变化情况。图3为LbL-MSCs和MSCs的扫描电镜图。图中a.为LbL-MSCs和MSCs在第1,3,7天时的扫描电镜图。图中b.为LbL-MSCs和MSCs在第1,3,7天时的鬼笔环肽染色的F肌动蛋白细胞骨架扫描电镜图。图中c.为用扫描电镜对LbL-MSCs和MSCs中单个细胞展开面积的定量比较。图4为灌注心肌梗死区域的Micro-CT检测图。图中a.为未处理组；图中b.为LbL-MSCs组；图中c.为Control-MSCs组；图中d.为VEGF组；图中e.为各组心肌梗死区域的灌注比率。图5为血管生成的免疫组化分析图。图中a,b,c分别为4周时Control-MSCs组、VEGF组和LbL-MSCs组的缺血心肌中血管密度情况；图中d,e,f分别为4周时Con本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系，其特征在于，由以下制备方法获得：(1)分离并培养具有趋化功能的细胞；(2)制备层层自组装负载生长因子缓释体系；①将步骤(1)获得的具有趋化功能的细胞置于15mL的离心管中离心，去除上清液；②在离心管中加入负载了生长因子的明胶溶液，将离心管置于37℃条件下震荡孵育5～10分钟，然后在2000rpm条件下离心5分钟，去除上清液，用PBS进行清洗，再次离心并去上清液。③在离心管中加入负载了生长因子的海藻酸盐溶液，将离心管置于37℃下震荡孵育5～10分钟，2000rpm条件下离心5分钟，去除上清液，用PBS进行清洗，再次离心并去上清液；④重复所述步骤②、③过程几次便获得具有层层自组装结构的具有趋化功能的细胞负载生长因子缓释体系。

【技术特征摘要】
1.一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系，其特征在于，由以下制备方法获得：(1)分离并培养具有趋化功能的细胞；(2)制备层层自组装负载生长因子缓释体系；①将步骤(1)获得的具有趋化功能的细胞置于15mL的离心管中离心，去除上清液；②在离心管中加入负载了生长因子的明胶溶液，将离心管置于37℃条件下震荡孵育5～10分钟，然后在2000rpm条件下离心5分钟，去除上清液，用PBS进行清洗，再次离心并去上清液。③在离心管中加入负载了生长因子的海藻酸盐溶液，将离心管置于37℃下震荡孵育5～10分钟，2000rpm条件下离心5分钟，去除上清液，用PBS进行清洗，再次离心并去上清液；④重复所述步骤②、③过程几次便获得具有层层自组装结构的具有趋化功能的细胞负载生长因子缓释体系。2.根据权利要求1所述一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系，其特征在于：所述具有趋化功能的细胞选自间充质干细胞、单核细胞和其祖细胞及由其分化而得的细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、纤维母细胞、上皮细胞、成肌细胞、肌腱细胞、单核造血干细胞和其祖细胞以及由其分化而得的细胞、免疫细胞、多核细胞、巨细胞、巨噬细胞和破骨细胞；所述生长因子选自血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、转移生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素、神经生长因子以及红细胞生成素。3.根据权利要求2所述一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系，其特征在于：分离并培养所述间充质干细胞的步骤包括：1)取健康的SD大鼠，断颈处死后置于超净工作台，酒精浸泡清洗，解剖暴露出骨髓腔；2)用含有肝素的完全培养基反复冲洗骨髓腔，并收集骨髓细胞悬浮液，将悬浮液贴壁加入MSC生长培养基中进行培养；3)待原代细胞生长接近铺满瓶底80％时，进行传代培养。4.根据权利要求3所述一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系，其特征在于：所述MSC生长培养基为含有10％的FBS和抗生素的α-MEM培养基，所用的培养方法为全骨髓贴壁法，培养条件为置于37℃,5％CO2,95％饱和湿度培养箱中培养。5.根据权利要求2所述一种以间充质干细胞为载体通过层层自组装负载VEGF缓释体系，其特征在于：所述负载了VEGF的明胶溶液的用量为5～10mL，制备方法是将5～15μg的VEGF与0.05％～0.1％明胶溶液进行混合，使VEGF吸附在明胶中；所述负载了VEGF的海藻酸盐溶液的用量为5～10mL，制备方法是将5～15μg的VEGF与0.05％～0.1％海藻酸盐溶液进行混合，使VEGF吸附在海藻酸盐中。6.一种以间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱楚洪，刘歌，曾文，李刚，秦钟梁，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50