在97与98位之间具有至少一个额外氨基酸残基的I-S1和I-S2亚组枯草杆菌酶制造技术

本发明专利技术涉及在９５－１０３位点的活性位点（ｂ）环区内的９７位中含有额外的氨基酸残基之Ｉ－Ｓ１和Ｉ－Ｓ２亚组的枯草杆菌酶。枯草杆菌酶变体在洗涤剂中的洗涤性能相比于其亲本酶有所改良。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的I-S1和I-S2亚组的枯草杆菌酶(subtilase)，其在从95-103位的活性位点环(b)区中的97位具有至少一个额外的氨基酸残基。这些蛋白酶当用于洗涤剂、清洁和洗涤剂组合物时，显示出色的或改良的洗涤性能。本专利技术还涉及编码用于所述酶表达的基因，当所述基因插入适当的宿主细胞或生物时表达所述酶。本专利技术还涉及用所述基因转化的且能够表达所述酶变体的宿主细胞，以及制备新型酶的方法专利技术背景在洗涤剂工业中，酶在洗涤配方中的应用已经超过30年。用于这些制剂的酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶以及其它酶，或者它们的混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。越来越多的商业上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，如DURAZYM(Novo Nordisk A/S)、RELASE(NovoNordisk A/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(Genencor国际有限公司)。还有许多蛋白酶变体在本领域中已有描述，如EP 130756(GENENTECH)(相应于美国再颁专利34,606(GENENCOR))；EP214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然(Nature)318 375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193 803-813；Russell和Fersht(1987)自然328496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(AMGEN)；WO95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAYS.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)；WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)和WO94/02618(GIST-BROCADES N.V.)。然而，尽管已经描述了许多有用的蛋白酶变体，许多工业用途仍然需要新的改良的蛋白酶或蛋白酶变体。因此，本专利技术的目的是提供改良的蛋白酶或蛋白质工程化蛋白酶变体，尤其是用于洗涤剂工业。专利技术概述本专利技术人发现了这样的枯草杆菌酶，其中至少一个活性位点环比那些已知的长，所述酶在洗涤剂组合物中显示改进的洗涤性能。在构建尤其是枯草蛋白酶309(BLSAVI或SAVINASE)的枯草蛋白酶(subtilisin)变体中对其进行了鉴定，相对于亲本野生型酶该酶显示出改进的洗涤特性。这一点在我们早先的申请DK1332/97中已描述。已知I-S1(真“枯草蛋白酶”)或I-S2(高碱性枯草蛋白酶)亚组中的某些枯草杆菌酶或其变体在从95-103位的活性位点环(b)区中的97位(或在97位与98位之间)具有至少一个额外的氨基酸残基，与目前已知的那些和在所述申请中描述的那些相比，所述酶显示出人意料的改良的洗涤性能。97位插入变体(在WO 99/27082中描述)包括G97GASG，G97GAA，G97GAS，G97GAS+A98S+S99G，G97GGG+A98S+S99G，G97GAA+A98S+S99G，G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A和G97GAA+A98S+S99G+S101T。这些变体不包括在本专利技术的范围内。本专利技术改进的蛋白酶可通过从自然资源中分离获得，或通过在野生枯草杆菌酶的97与98位之间的活性位点环(b)中导入至少一个额外的氨基酸残基(一个插入)获得(对于活性位点环和位置编码见下述)。尽管本发现是在枯草蛋白酶309中进行，预计可能产生或分离类似有益的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体。此外，可能通过特异地筛选天然分离株，以鉴别新的野生型枯草杆菌酶，其含有至少一个比已知野生型枯草杆菌酶相应活性位点环更长的活性位点环(b)，如枯草蛋白酶309，该枯草杆菌酶被认为在97与98位之间具有一个插入的氨基酸残基，且与最相关的已知枯草蛋白酶(如枯草蛋白酶309)相比显示在洗涤剂中出色的洗涤性能。相关的序列比较及编码参照见如下附图说明图1、1a、2和2a，显示枯草蛋白酶BPN’(a)(BASBPN)和枯草蛋白酶309(b)(BLSAVI)之间的序列比较，以及枯草蛋白酶BPN’(BASBPN)(a)和枯草蛋白酶Carlsberg(g)之间的序列比较。这些序列比较在本专利技术中用做残基编码的参照。在此定义了七个活性位点环(a)至(g)(包括所示的两个末端的氨基酸残基)以涵盖如下区段的氨基酸残基(a)氨基酸残基33-43之间的区域；(b)氨基酸残基95-103之间的区域；(c)氨基酸残基125-132之间的区域；(d)氨基酸残基153-173之间的区域；(e)氨基酸残基181-195之间的区域；(f)氨基酸残基202-204之间的区域；和(g)氨基酸残基218-219之间的区域。因此，本专利技术第一方面涉及一种分离的(即纯度＞10％)的I-S1和I-S2亚组的枯草杆菌酶，其在从95-103位的活性位点环(b)区中的97位具有至少一个额外的氨基酸残基，由此所述额外氨基酸残基相应于在97-98位之间至少一个氨基酸残基的插入片段，前提是所述枯草杆菌不含有如下插入片段G97GASG，G97GAA，G97GAS，G97GAS+A98S+S99G，G97GGG+A98S+S99G，G97GAA+A98S+S99G，G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A和G97GAA+A98S+S99G+S101T. 本专利技术第二方面涉及编码本专利技术枯草杆菌酶变体的分离DNA序列。本专利技术第三方面涉及含有编码本专利技术枯草杆菌酶变体的分离DNA序列的表达载体。本专利技术第四方面涉及转化了第三方面的表达载体的微生物宿主细胞。本专利技术还涉及本专利技术的枯草蛋白酶的生产。本专利技术的酶可一般地通过如下方法生产，培养微生物并从中分离且以基本上纯的形式回收酶；或者通过将第三方面的表达载体插入到合适的微生物宿主中，培养宿主以表达需要的枯草杆菌酶，并回收酶产品。本专利技术还涉及含有本专利技术枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的组合物。最后本专利技术涉及本专利技术的酶在许多工业相关应用中的用途，特别是在清洁组合物中的用途，以及在含有突变酶的清洁组合物，尤其是含有突变枯草杆菌蛋白酶的洗涤剂组合物中的用途。定义在进一步详细论述本专利技术之前，先定义下列术语。氨基酸的命名A＝Ala＝丙氨酸V＝Val＝缬氨酸L＝Leu＝亮氨酸I＝Ile＝异亮氨酸P＝Pro＝脯氨酸F＝Phe＝苯丙氨酸W＝Trp＝色氨酸M＝Met＝甲硫氨酸G＝Gly＝甘氨酸 S＝Ser＝丝氨酸T＝Thr＝苏氨酸C＝Cys＝半胱氨酸Y＝Yyr＝酪氨酸N＝Asn本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｉ－Ｓ１和Ｉ－Ｓ２亚组的枯草杆菌酶，其在从９５－１０３位的活性位点环（ｂ）区中的９７位具有至少一个额外的氨基酸残基，由此所述额外氨基酸残基相应于在９７－９８位之间至少一个氨基酸残基的插入片段，前提是所述枯草杆菌酶不含有如下插入片段： Ｇ９７ＧＡＳＧ，Ｇ９７ＧＡＡ，Ｇ９７ＧＡＳ，Ｇ９７ＧＡＳ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＧＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＡＳＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｇ１００Ａ＋Ｓ１０１Ａ或Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ ９９Ｇ＋Ｓ１０１Ｔ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K威尔波尔安德森，FF米凯尔森，P坎普汉森，M诺莱加德玛德森，C安德森，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]