昆虫病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供可用于将基因转移至植物、昆虫和其它宿主的昆虫病毒载体。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术在美国政府资助下完成(环保局的资助号为CR822902，美国农业部的资助号为58-3148-6-029和94-34190-1204，AGRICCREE的授予号为94-39210-0559)。美国政府在本专利技术中具有一定的权益。
技术介绍
植物中有用化合物(例如治疗剂、化学原料、化妆品和其它消费品)的合成以及用于作物改良的遗传工程(例如遗传工程抗病原体植物)是在全世界具有日益增加的经济重要性和研究价值的植物生物技术的两个领域(Miele，1997；Franken等，1997；Beachy，1997；Ma等，1996；Estruch等，1997；Palmgren，1997)。另外，植物基因组文库和EST文库的可用性正在改变着商业植物生物技术的潜力(Briggs等，1997；McKusick，1997；和Evans等，1997)。特别是，因为许多植物性状例如产量、收获指数、杂种优势和环境胁迫耐性受几种基因协同作用的调节，所以利用基因序列标志和基因组文库，提供了具有商业价值的基因的鉴定方法或所述基因的现成资源。正在开发基于几种植物病毒的载体，所述植物病毒例如烟草花叶病毒(TMV)、豇豆花叶病毒(CpMV)、雀麦花叶病毒(例如BMV)和马铃薯Y病毒组(Yusibov等，1997；Reimann-Phillip等，1993；Porta等，1996；Johnson等，1997；Kollar等，1993；Pruss等，1997)，以将选定基因导入植物中，以进行有用化合物的合成。基于病毒的载体为基因转移提供了补充农杆菌介导的转化和粒子轰击法的几个不同的优点。病毒载体易于操作，它们可以通过简单的接种而转移，并且它们在转染的植物中允许高水平的表达。然而，现有的基于植物病毒的载体系统有其限制。它们在其植物寄主中可以引起病害，范围从较轻的病害至灾难性病害。此外，它们本质上在田间是从一个植株自然传播至另一个植株，并且在某些情况下它们可以通过花粉或种子传播至下一代。而且，这些病毒的许多病毒的寄主范围窄，并且由于外源基因的可变表达而具有有限的实用性。罗达病毒(Nodavirus)是小的昆虫来源的无包被二十面体病毒。蚊子(三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、跗斑库蚊(Culex tarsalis)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)和Toxorhynchitesamboinesis)、印度谷斑螟和黑皮蠹(Plodia interpunctella鳞翅目和Attagenus piceus鞘翅目)的幼虫、蜡螟(Galleria mellonella鳞翅目)和蜜蜂(意大利蜜蜂(Apis mellifera)的幼虫是已知被罗达病毒感染、并且其中病毒感染引起麻痹和死亡的其中某些昆虫寄主(Tesh，1980；Bailey和Scott，1972)。代表性罗达病毒包括黑甲虫病毒(BBV)、禽兽棚病毒(FHV)、布拉拉病毒(BOV)和野田村病毒(Nodamura virus)(NOV)。这些病毒是仅有的已知信使有义的、高等或低等动物的二分基因组RNA病毒(关于综述，参见Hendry，1991)。二分基因组植物病毒是已知的，但其基因组部分在分开的病毒体中包衣壳(Bruening，1977)。罗达病毒的天然寄主是昆虫，然而罗达病毒可以在动物中繁殖(例如，NOV可以感染小鼠并且可能感染猪，参见Bailey和Scott，1972；Scherer和Hurlbut，1967；Scherer等，1968)，最近已经在海洋鱼类中发现罗达病毒(Mori等，1992；Nishizawa等，1995；Frerichs等，1996)，尽管FHV根本不在高等动物细胞中繁殖。另外，FHV在植物中快速繁殖，而不引起病症(Selling等，1990)。FHV可以通过机械摩擦叶片而被导入植物，或者可以通过用含病毒的溶液喷洒叶片而被导入。然而，FHV移动差，或根本不从感染部位转移。因此，需要将所需的或预选的核酸区段或序列系统或局部转移至植物、而不引起那些植物病害的载体。专利技术概述本专利技术提供一种可用于将基因转移至植物和动物(例如昆虫)的基于重组病毒核酸的基因转移载体。最好是，所述载体衍生自具有一个二分基因组包括单链线性RNA的病毒，例如罗达病毒(Hendry，1991)、香石竹病毒组(Dianthovirus)、烟草脆裂病毒组(Tobravirus)(Matthews，1991)等。因此，本专利技术提供一种包含连接的核酸序列的生物活性基因转移载体。所述连接的核酸序列包括一段来源于病毒核酸5’端(例如罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的5’端)的核酸序列；一段包含至少一个目的核酸区段的核酸序列；和一段来源于病毒核酸3’端(例如罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的3’端)的核酸序列。所述包含目的核酸区段的核酸序列最好编码植物病毒移动蛋白、植物病毒外壳蛋白(例如天然外壳蛋白或具有与天然外壳蛋白不同特性的修饰外壳蛋白)、生长激素、毒素(例如亚致死毒素，如生长素或Photorhabdus毒素)、细胞因子、抗病性、抗虫性、雄性不育性、可用于疫苗生产的病毒表面上的抗原性部位、或杀虫剂抗性；和/或包含一个合成基因、导向反义RNA序列/修饰植物特性的酶、标记基因或选择标记、或它们的任何组合。最好是，核酸区段包含经修饰以在植物中增强表达的序列。所述核酸区段最好是连接的，以便产生融合多肽。或者，可以将编码蛋白酶解部位的核酸序列导入每种核酸区段之间。任选的是，每种核酸区段可以操作性地连接于一个转录控制单位，例如启动子。本专利技术的载体可以与以下载体组合其它基于动物病毒的载体、基于植物病毒的载体或其它基于昆虫病毒的载体，例如基于烟草花叶病毒的载体(Beachy，1997)、基于杆状病毒的载体(Schneemann等，1993)或基于痘苗病毒的载体(Ball，1992)。本专利技术的一种优选载体在所述载体的5’端和3’端包含罗达病毒核酸，并且编码植物病毒移动蛋白(MP)。MP有助于病毒或病毒核蛋白(遗传物质加“载体蛋白”)从植物细胞转运至植物细胞。因此，MP在具有本专利技术载体的植物细胞中的表达，导致载体序列传播至周围植物细胞，这导致那些序列的局部或瞬时传播和表达。因此，当需要瞬时或定位表达并且所述表达足够(如在高通量筛选/基因组学(genomics)中)时，与转基因法相比，本专利技术载体的传播可以显著减少表达筛选时间。另外，由于罗达病毒、香石竹病毒组和烟草脆裂病毒组可以通过简单地机械摩擦叶片而传播，因此基于这些病毒的载体可以用于现有的植物品种上，而无需制备转基因形式。特别是，本专利技术提供了一种作物改良方法，所述方法避免了制备转基因作物所需的耗时且昂贵的方法，并且避免了与转基因法相关的种子库和种质保藏中心的外源基因污染的可能性。本专利技术还提供一种将预选核酸序列导入宿主细胞的方法。该方法包括使宿主细胞与表达所述预选核酸序列有效量的本专利技术载体接触，而无需产生感染性病毒粒子。如果所述宿主是一种有机体，没有感染性病毒则完全消除了任何意外的和不希望有的对宿主(例如昆虫或人类)的威胁。最好是，对于植物宿主而言，所述接触包括机械摩擦例如叶片。本专利技术还本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物活性基因转移载体，所述载体包含连接的核酸序列，所述核酸序列包含：（ａ）一段来源于罗达病毒ＲＮＡ－１或罗达病毒ＲＮＡ－２的５’端的核酸序列；（ｂ）一段包含至少一个目的核酸区段的核酸序列；和（ｃ）一段来源于罗达病毒ＲＮＡ－１ 或罗达病毒ＲＮＡ－２的３’端的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：RK达斯古普塔，R古德曼，
申请(专利权)人：威斯康星旧生研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]