利用抗CD20抗体治疗移植物抗宿主疾病制造技术

本发明专利技术描述了用抗不存在于正常人Ｔ淋巴细胞上的外源表面抗原的抗体制备组合物，用于对已接受了被该外源表面抗原转导的Ｔ淋巴细胞的患者进行移植物抗宿主疾病的治疗。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术简述本专利技术涉及利用抗不存在于正常人T淋巴细胞上的外源表面抗原的抗体，制备治疗移植物抗宿主疾病的组合物，用以治疗接受了被该外源表面抗原转导的T淋巴细胞的患者。尽管利用目前的标准免疫筛选技术已能够很容易地生产出大量的纯化的供体T淋巴细胞，并通过其服用达到体内诱导GVL的效果，但目前仍缺乏适当的技术，从药学上诱导服用的T淋巴细胞的选择性死亡，从而达到一旦临床上不需要时能够消除GVHD作用。过去已生产出许多抗人表面分子的多克隆和单克隆抗体。在许多情况下，生产抗体的直接目的在于在体内杀死对那些用于免疫治疗方案的分子呈阳性的细胞。例如，在B淋巴瘤领域已生产和鉴定出抗CD20、CD19、CD40、CD22、CD52、CD38分子及其它分子的有效抗体(P.S.Multani等，J.Clin.Oncol.，16，3691-3710，1998)。在某些情况下，抗这类分子的抗体显示出体内细胞毒性作用，可能是因为他们象CD20、CD38和C厮2一样，能够激活靶细胞表面的补体系统。在其它一些情况下，是将抗体与放射活性分子结合以诱导靶辐解，就如同CD20、Lym-1等一样。其它一些抗体则是与细菌或植物来源的毒素结合，用于同样目的，就如同CD19、CD40和CD22一样。还有一些抗体则被嵌合以获得双特异性，从而使两种细胞充分接近。最后，还存在许多这些抗体的人工改造的和/或人源化的形式，它们的体内给药既降低了抗原性危险，又增强了其效力。专利技术详述现已发现，通过利用本专利技术的方法可有效地控制移植物抗宿主疾病问题，该方法包括将外源表面抗原引入供体的T淋巴细胞，然后给受体患者服用抗该外源抗原的抗体。外源抗原意指不存在于正常T淋巴细胞上的任何表面抗原，如CD20、CD19、CD40、CD22、CD52等表达在B淋巴细胞表面的抗原。显然，在与相应抗体反应后将对该抗体进行筛选，以便不在有组织地表达抗原的细胞群体水平上产生负面或不良效果。尤其优选的是人B淋巴细胞的CD20表面抗原，抗该抗原的人源化单克隆抗体可从市场上买到(Rituximab，Roche)，它用于治疗非霍奇金B淋巴瘤(B non Hodgkin lymphomas)。根据本专利技术，首先通过适当技术用选择的抗原转导供体T淋巴细胞，通过免疫亲和方法使其富集后将其注射到受体。如果有移植物抗宿主疾病形成，则给患者服用抗该抗原的抗体，以便通过例如补体介导的细胞毒性机制体内灭活T淋巴细胞。所用抗体优选为单克隆抗体，更优选人源化的单克隆抗体。其剂量和给药途径取决于多种因素，包括患者的整体健康状态、体重、性别和年龄。一般地，该抗体通过静脉内途经给药，其剂量范围约为50-500mg/m2体表，每日1-3次，直至循环T淋巴细胞几乎完全消失。Rambaldi等人(Blood，91，2189-2196，1998)已描述过T淋巴细胞的分离。用所需抗原转导T淋巴细胞的方法是熟知的。可参见Verma.I.M和Somia的综述(Nature，389，239-242，1997)。具体地，可使用适宜的载体，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒(Lentiviruses)等。这些载体中的每一种均包括许多不同的生物类型。对于逆转录病毒，其例子有兼嗜性载体、亲嗜性载体和异嗜性载体。而且，多年来还使用了许多不同的包装细胞系，以便优化这类重组逆转录病毒的生产，并确保易于操作和生产者的安全(I.M.Verma等，Nature，389，239-242，1997；M.A.Kay等，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。最近，通过与多聚阳离子或脂质体复合物结合、电穿孔、在盐缓冲液中沉淀及其它技术，也已将裸DNA引入靶细胞中。许多不同细胞类型已被定向遗传转移T和B淋巴细胞、未成熟造血前体、肌肉细胞、成纤维细胞、肝细胞和其它细胞类型(I.M.Verma等人，Nature，389，239-242，1997；M.A.kay等人，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。对于CD20抗原，已使用了一种兼嗜性逆转录病毒。该病毒来源于莫洛尼鼠类白血病毒并被包装在胚肾人细胞(293T)中，而该胚肾人细胞已经过人工改造，含有分散在不同质粒中的逆转录病毒的结构单元(Human Gene Therapy，7，1405-1413，1996)。这类载体以及用外源抗原转导的T淋巴细胞(尤其是CD20+T淋巴细胞)是本专利技术的目标之一。经过遗传转移之后，显著表达外源基因的细胞仅占到总细胞群中的少部分。利用能够给细胞带来选择性优势的外源基因，可对转导细胞实施筛选。也可采用其它方法如用抗外源抗原的抗体进行FACS分类，筛选转导细胞(K.Phillips等人，Nature Medicine，2，10，1154-1155，1996)。其它方法还包括用于筛选方法中的免疫亲和层析柱或预吸附的培养板等。图2用CD20感染CEM细胞系及免疫筛选。其中上图A利用荧光对照IgG1抗体，通过细胞荧光测定仪分析病毒感染后的CEM细胞系。中图B利用荧光抗CD20抗体分析同样的细胞群。下图C利用荧光抗CD20抗体分析经亲和柱免疫筛选后的同样细胞群。图3用CD20病毒感染人新鲜T淋巴细胞上图A感染后淋巴细胞用PEIgG2a和FITC IgG1对照抗体标记。下图B同样细胞群用抗CD20 PE和抗CD3 FITC抗体标记。在所示情况下，23％的细胞为双阳性。下面的实施例用于进一步详细说明本专利技术。为了放大，在含2.5mM dNTP、500ng“有义”引物(CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC)、500ng“反义”引物(CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT)和5u pfu DNA聚合酶(购自Stratagene，La Jolla，CA，USA)的0.8μl溶液存在的情况下，将40ng质粒加至由10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/ml BSA组成的溶液中，至反应终体积100μl。按下述方案将反应在循环器中进行26次循环95℃1分钟，60℃1分钟和72℃2分钟。反应结束时，加入25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液100μl。萃取后，在乙醇存在下于20℃过夜沉淀DNA。离心后，将DNA重悬于100μl水中，然后按附带在“pMOS平末端克隆盒“中的生产商指示将其亚克隆至PMOS载体(AmershamItalia，srl，Italy)。将所产生的重组质粒放大并测序，然后用BamHI消化。该酶的识别位点(G/GATCC)存在于两种PCR引物的末端。因此，该片段被亚克隆在逆转录病毒载体PINCO VUOTO的BamH1位点。逆转录病毒载体PINCO VUOTO已通过下列方法预先获得用RcoRI和NotI从质粒PINCO(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)中切除1441bp的片段，该片段含有CMV启动子(巨细胞病毒)和EGFP(增强的本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用抗正常人Ｔ淋巴细胞中不存在的外源表面抗原的抗体制备组合物，用于对已接受了被该外源表面抗原转导的Ｔ淋巴细胞的患者进行移植物抗宿主疾病的治疗。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J高雷，M因特拿，A伦巴迪，A比翁迪，
申请(专利权)人：国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]