一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体Ａ１及其用途，给出了单链抗体Ａ１的ＤＮＡ序列，及其该单链抗体的制备方法，以及该单链抗体在对虾白斑杆状病毒诊断中的应用。单链抗体Ａ１可直接用于诊断对虾白斑杆状病毒，适合对虾病毒病的早期检测，通过大杆菌的繁殖，即可获得大量的单链抗体Ａ１，比多克隆抗体和单克隆抗体的制备要简便，并且费用要低得多。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖生物病毒的抗体，更具体涉及一种能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体。1993年以来，我国虾病爆发性流行，引起养殖的对虾大面积死亡，经济损失惨重。研究表明，其主要是由一种新的没有包涵体的C型杆状病毒—对虾白斑杆状病毒所致。该病毒可以感染我国所有人工养殖的对虾种类，感染性强，发病快，死亡率高，给对虾养殖业带来极大的危害；据报道，其它国家和地区也有类似情况。目前，对对虾病毒病尚无有效的治疗方法，避免与病毒病源接触被认为是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速诊断。目前的诊断方法主要有PCR、核酸探针技术和酶联免疫吸附技术。PCR检测法虽然灵敏度非常高，但费用昂贵。核酸探针技术对技术条件要求高，检测时间长，广大虾农掌握此技术难度很大，难以推广；酶联免疫吸附技术虽可在养虾场应用，但由于此法所需的多克隆抗体和单克隆抗体制备麻烦、费用高，限制了该技术的应用和发展。因此，早期快速、简便地诊断对虾白斑杆状病毒的关键是能大批量、方便、低价制备识别对虾白斑杆状病毒的抗体。本专利技术的目的是提供一种能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1，该单链抗体可批量生产，并可用于对对虾白斑杆状病毒的快速诊断。本专利技术的一种能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1，其DNA序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGNTATCNACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCA其制备方法为首先从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒，将抗体片段的基因克隆到丝状噬菌体N-末端第三蛋白基因区域，表达的融合蛋白在噬菌体尾尖表面展示。具有抗原结合活力的抗体片段若由重链和轻链的可变区域组成，由一可弯曲的小肽连接成为氨基酸单链的形式，称为单链抗体。单链抗体片段的获得是通过PCR技术对免疫过或未免疫的小白鼠脾脏mRNA进行反转录和扩增，克隆到噬菌体表达载体上。具有抗原结合活力的噬菌体抗体可直接利用抗原亲和性从重组噬菌体抗体文库中淘选，通过再感染大杆菌及菌体扩增培养，可获得本专利技术所述的A1单链抗体。其具体制备方法包括如下步骤1、采用蔗糖密度梯度超速离心法，用电镜检测，从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒。2、用蛋白量为20～150μg纯化的完整对虾白斑杆状病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐剂或福氏佐剂或氢氧化铝等常用佐剂，经17～26天进行二次或三次免疫，再经3～5天用酶联免疫印迹法和酶联免疫吸附法测定抗体效价，取抗体效价最高的小鼠脾脏，从中提取mRNA。3、将此mRNA反转录为cDNA，再用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增。4、用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接起来组成单链抗体DNA，再用对应单链抗体DNA的引物用PCR技术将整个片段扩增。5、将单链抗体DNA片段两端的限制性内切酶位点(SfiI和NotI)酶切，再与具同样酶切位点的噬菌体表达载体连接，电转移至大肠杆菌中，可获得较高效价的噬菌体抗体cDNA文库(＜107)。6、用吸附在朔料管壁上的对虾白斑杆状病毒对上述噬菌体抗体文库进行1～4次淘选，用酶联免疫吸附法筛选可得到抗原结合专一性的阳性克隆，该阳性克隆分泌的单链抗体可专一性识别对虾白斑杆状病毒。7、选取具有较强ELISA信号的菌株，用于制备可溶性单链抗体，即为可专一识别对虾白斑杆状病毒的A1单链抗体。本专利技术的优点与效果单链抗体A1可直接用于诊断对虾白斑杆状病毒，适合对虾病毒病的早期检测，通过大杆菌的繁殖，即可获得大量的单链抗体，比多克隆抗体和单克隆抗体的制备要简便和便宜得多。实施例对虾白斑杆状病毒的诊断。1)将5μL待测样品对虾血淋巴液点于硝酸纤维素膜上。2)将膜放入10ml 4％脱脂奶粉/PBS中，于室温放置1分钟。3)再将膜浸入5ml 0.025mol/L重铬酸钾溶液中，室温放置10分钟，使对虾血淋巴中的氧化酶类失活。4)用PBS将膜洗3次。5)将膜与3ml含有单链抗体A1的大肠杆菌培养液，在室温下保温10分钟。6)用0.1％吐温-20/PBS将膜洗3次，再用PBS洗三次。7)将膜与3ml 4％脱脂奶粉/PBS 1∶8000倍稀释的抗单链抗体E-tag的免抗鼠IgG/辣根过氧化物酶在室温下保温10分钟。8)将膜用吐温-20/PBS洗3次，再用PBS洗3次。9)将6mg二氨基联苯胺，10μl H2O2加入到10ml 50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)，PH 7.6中，制成底物溶液，再将膜放入底物溶液中，反应10分钟，有褐色斑点即为病毒阳性。权利要求1.一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1，其特征是，该单链抗体的DNA序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体Ａ１，其特征是，该单链抗体的ＤＮＡ序列如下： ＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＧ ＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴ ＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴ ＣＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＡＧＣ ＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧ ＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＣＣＣＴＧＧＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴ ＣＴＣＣＧＴＧＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＡＧ ＡＣＧＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣ ＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＣＴＧＮＴＡＴＣＮＡＣＡＧＡＡＡＣＣ ＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧ ＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧ ＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧ ＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高宏，赵新颜，张宪孔，戴玲芬，赵若虹，韩明申Seam，MHanmingsen，戴和平，
申请(专利权)人：高宏，赵新颜，张宪孔，戴玲芬，赵若虹，韩明申Seam，MHanmingsen，戴和平，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]