重组人甘露聚糖结合型凝集素制造技术

本发明专利技术涉及对免疫系统疾病的治疗，包括对免疫系统中的缺陷的治疗。本发明专利技术包括制备一种新的编码人ＭＢＬ的表达构建体，一种新的与天然人ＭＢＬ有高度相似性的重组人ＭＢＬ制剂，还包括该化合物在组合物、药物、以及在治疗诸如与免疫抑制状态相关和／或与ＭＢＬ缺陷状态（包括潜伏状态）相关的状态中的应用。甘露聚糖结合型凝集素（ＭＢＬ）缺陷状态与对感染的易感性增加有关。更具体地，本发明专利技术涉及对所述状态（包括潜伏状态，即目前尚不需要治疗的状态）的治疗。所述治疗针对人类，以及免疫系统行为类似于人的动物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备含MBL的组合物的方法，还涉及免疫系统疾病和障碍的治疗，包括免疫防御系统内部缺陷的治疗。更具体而言，本专利技术涉及与感染易感性增加相关的甘露聚糖结合凝集素(MBL)缺陷或其潜伏状态的治疗。本专利技术进一步涉及编码人MBL的新表达构建体的制备，一种新的人MBL重组制剂，而且还包括在与免疫抑制性化疗等相关的状态和/或MBL缺陷状态(包括潜伏状态，即非即需)等病情的治疗方法中使用该化合物。所述的治疗针对人，以及免疫系统行为与人免疫系统相似的动物。
技术介绍
免疫系统包括一套复杂的识别和靶向病原微生物或其感染细胞的细胞和分子机制。最近，MBL作为先天免疫系统的重要组成部分很受关注，先天免疫系统是指在出生时就起作用的免疫系统，相反，适应性免疫防御只是在婴儿期获得其全部的保护身体的能力(Janeway等，1999)。依靠与微生物表面的碳水化合物结合，MBL介导补体系列成分的激活，即一系列的酶激活步骤，最终锁定目标以便通过吞噬或溶解微生物而破坏目标(Law和Reid，1995)。补体系统通过至少三个不同的途径激活，分别称为经典途径、替代途径和MB凝集素途径(Janeway等，1999)。经典途径以补体因子1(C1)识别表面结合的免疫球蛋白为起始。C1复合物由两种蛋白分解酶，C1r和C1s，以及具有免疫球蛋白识别结构域的非酶性部分C1q组成。C1q和MBL具有共同的结构特点，用电子显微镜观察时，这两种分子都具有花环样外型。与C1q相似，MBL也与两种蛋白分解酶，即甘露聚糖结合型凝集素相关蛋白酶(MASP)形成复合物。这三种途径均产生与激活表面即所靶定的微生物病原体表面结合的补体因子3的转换酶(C3转换酶)。C3向表面结合型C3b的转换在通过吞噬或溶解作用消除微生物病原体的过程中是关键步骤(Janeway等，1999)。甘露聚糖结合型凝集素(MBL)，也称为甘露聚糖结合蛋白或甘露糖结合蛋白(MBP)，首先是在家兔中鉴定的(Kawasaki等，1978)。甘露聚糖结合型凝集素(MBL)属于一组可溶性Ca2+依赖性(C-型)凝集素，它们含有C-末端碳水化合物识别结构域和胶原样区域，后者以甘氨酸(Gly)及其后两个非甘氨酸氨基酸组成的重复三联体基序为特点。因此MBL属于胶原凝集素(collectin)，即具有胶原样区域的C-型凝集素，它还包括肺表面活性蛋白A和D以及共凝集素和CL-43，但是这些成分仅在牛群中得到鉴定(Holmskov等，1994)。人MBL蛋白由多达18个相同的32kDa多肽链组成(Lu等，1990)，每个多肽链包括21个氨基酸的短N末端片段，其中含三个半胱氨酸，其后是7个胶原基序Gly-X-Y重复序列，中间插入一个Gln残基，随后又是12个Gly-X-Y重复序列。一段小的34残基“颈区”将93个氨基酸的C末端Ca2+依赖性凝集素结构域与该分子的胶原区域结合(Sastry等，1989)。三个MBL多肽链结合成MBL亚单位。MBL由多达6个15nm MBL亚单位茎组成在底部结合的花环。后来在啮齿类动物(Miznuno等，1981；Oka等，1988)、牛(Holmskov等，1993a；Kawai等，1997)和鸡(Oka等，1985；Lauren等，1995；Laursen等，1998)中鉴定出了MBL。在啮齿类动物(Drickamer等，1986)和恒河猴(Mogues等，1996)中发现了两种类型的MBL基因，通常称为A型和C型。在大鼠中发现了MBL“B”假基因(Drickamer等，1986)，最近又从人基因组中克隆了MBL假基因，序列分析表明这是灵长类MBL-A基因的残迹(Guo等，1998)。人MBL是Kawasaki等在1983年发现的。目前仅鉴定出一个活性人MBL基因，它包括MBL基因中的四个外显子和三个间插内含子，长度约为6kb，位于10q11.2-q21(Sastry等，1989；Taylor等，1989)。所述三条多肽链的胶原区域组成一个亚单位，通过二硫键使其稳定。通过二硫键以及非共价相互作用将各个亚单位结合(Lu等，1990)。然而，这些二硫键的位置还没有完全确定。在非还原条件下MBL的SDS-PAGE分析中出现了表观分子量(m.w.)大于200kDa的条带，可能代表由3、4、5和甚至6个亚单位组装成的大分子(Lu等，1990)。对于天然人MBL蛋白中亚单位的实际数目还存在争议。Lipsombe等(1995)通过应用超离心得到的数据表明25％的人血清MBL是由2-3个亚单位组成，只有很少一部分达到6个亚单位。通过经化学发光显示的Western印迹密度测定法，可进行相对定量。由于把高分子量蛋白转移到膜的效率低于低分子量蛋白，使得通过这种方法进行分析十分复杂。Lu等(1990)通过对离子交换层析的组分进行SDS-PAGE分析，发现主要的共价结合型MBL亚单位链是由四聚体组成，而只有五聚体或六聚体复合物可激活补体。相反，凝胶渗透层析(GPC)分析表明MBL的大小与C1复合物相当。可以在适当的条件下进行GPC，该条件允许对蛋白-蛋白的弱相互作用在MBL分子形成过程中的重要性进行研究，并联合标准的MBL分析对GPC组分中MBL含量进行无偏测定。MBL的体内作用似乎主要作为介导一些抗微生物活性的体液因子与先天免疫系统相关，不需要成熟到可进行象T或B细胞识别为基础的适应性免疫防御系统那样的自身/非自身鉴别，如(Janeway等，1999；Vorup-Jensen等，1998)。MBL结合靶点的识别由C-型凝集素结构域介导。C型CRD在多种蛋白中发现，它们可能具有系统发生和功能前景意义。至于MBL，CRD优先识别带有平展的(equatorial)3-和4-OH基团的己糖，例如甘露糖和N-乙酰葡糖胺，而不与不符合这种空间需要的糖，例如半乳糖和D岩藻糖结合(Weis等，1992)。末端CRD的结合方式应使得目标表面存在约53间距的结合位点以便与所有三个结构域结合(Sheriff等，1994；Weis和Drickamer，1994)。“模式识别”的这种特性使得可以进一步对微生物表面进行选择性结合。很明显，碳水化合物选择性是MBL自身/非自身区分的重要方面，并且其可能是由微生物表面上的甘露糖和N-乙酰葡糖胺优势程度的差异所介导，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)等酵母细胞壁中含大量甘露糖。哺乳动物蛋白糖基化中，糖结构通常以唾液酸结束，唾液酸可以阻止MBL与这些低聚糖结合，因此阻止了MBL识别“自身”表面。每个MBL亚单位的三聚体结构对目标识别可能也起重要作用。通过利用体外合成体系，已经进行了一些MBL结构和生物合成方面的研究。通过结晶大肠杆菌产生的重组蛋白，确定(resolved)了大鼠MBL-A的CRD的结构(Weis等，1992)，通过利用重组材料，同样地确定了大鼠MBL-C的结构(Ng等，1996)。最近，通过表达“颈区”和CRD而组装的CRD三聚体的晶体结构证实了早期关于“颈区”通过盘绕的α螺旋之间的氢键将三条链聚集在一起的研究(Sheriff等，1994；Weis和Drickamer，1994)本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备大小分布谱与天然人ＭＢＬ至少有５０％相同的人重组甘露聚糖结合型凝集素（ＭＢＬ）组合物的方法，包括如下步骤：－制备编码人ＭＢＬ肽或其功能等价体的基因表达构建体，－用该构建体转化宿主细胞培养物，－培养该宿主细胞，从而使所述多肽表达并将其分泌到培养基中，随后，－将该培养基在碳水化合物衍生化基质中进行亲和层析，该碳水化合物衍生化基质对ＭＢＬ亚单位的四聚体、五聚体和／或六聚体的亲和力比对ＭＢＬ亚单位二聚体的亲和力至少高２倍，－获得包含人重组ＭＢＬ组合物的洗脱物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬蒂尔，詹斯C詹斯尼厄斯，托马斯V詹森，
申请(专利权)人：斯蒂芬蒂尔，詹斯C詹斯尼厄斯，托马斯V詹森，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]