使用昆虫细胞制备的人乳铁蛋白及其制备方法技术

制备工艺包括在载体（ｐＢａｃＰＡＫ）中合成转移载体和再混合质粒调节多角体蛋白启动子，乳铁蛋白基因制备重组表达载体（ｐＢａｃＬｆ）（３）；在培养基介质中的昆虫细胞借助载体（ｐＢａｃＰＡＫ）（６）共转移重组揭示载体制备重组昆虫细胞（Ｓｆ－Ｌｆ）（６），从重组昆虫细胞制备重组昆虫病毒；从重组昆虫细胞制备人乳铁传递蛋白；本发明专利技术的重组人乳铁蛋白的生物检验方法是观察在从重组昆虫细胞提取重组人类乳铁传递蛋白并将它和致病细菌如洋葱假单胞菌，恶臭假单胞菌，荧光假单胞菌，鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌混合后，杀灭致病细菌的速率。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及采用昆虫细胞制备的人乳铁蛋白及其制备方法。具体地说，本专利技术涉及采用昆虫细胞制备的人乳铁蛋白及其制备方法，这种方法包括通过基因重组将人乳铁蛋白基因转导进入昆虫细胞，以及在昆虫细胞中克隆和表达人乳铁蛋白基因，利用昆虫细胞制备人乳铁蛋白。人乳铁蛋白是离子结合的单体糖蛋白的铁传递蛋白家族的一员，也称作“乳铁传递蛋白”。这种人乳铁蛋白存在于哺乳动物的奶液包括人的乳液、泪液、唾液、粘膜分泌物和多形核白细胞的次级颗粒体中。1939年，Peter Sorenson首先发现，开始命名为人类乳液的“红蛋白质”。乳铁蛋白(Lf)首先从牛奶中被分离和提纯。自从第一次发现乳铁蛋白后，已经从其他哺乳动物例如人、鼠、山羊、兔、狗等等的乳液中分离和提纯Lf。人类的乳液有较高量的乳铁蛋白，例如初乳中为6到8mg/ml。但是，在输送乳液时人乳中的乳铁蛋白含量下降到大约2mg/ml。如果人乳在输送过程中被细菌污染，在被污染的奶中，乳铁蛋白的量突然升高到比正常乳铁蛋白的量高30倍以上。人乳铁蛋白(hLf)是一种分子量为78kDa的糖蛋白，由含有691个氨基酸的单个多肽链组成。这个单个多肽由一个2折内重复单元和两个球状叶片组成。即人乳铁传递蛋白有C和N叶片分别构成了C端和N端。这两个叶片有非常相同的结构，C端和N端之间具有高度同源性(高达大约40％以上)。采用近代先进的X射线晶体学测定了乳铁蛋白的三维结构，每一个C端和N端有一个结合具有高亲和性的铁的位点，而且这样的一个乳铁蛋白分子可逆地结合两个铁离子(Fe+3)(Anderson等，1989)。这样的一个乳铁蛋白可以以无铁状态(apo型)或是饱和铁状态(holo型)存在，这取决于它是否结合了铁，因而决定了乳铁蛋白的生物学特性。Apo型乳铁蛋白存在于正常的人乳汁中。在酸性条件下所有类型的乳铁蛋白相对于铁传递蛋白几乎都是稳定的，并且在特定的pH值释放铁。乳铁蛋白是从外分泌腺分泌的非—免疫球蛋白保护蛋白质之一，直接或间接参与抗菌机制并且因此影响抗病毒作用。乳铁蛋白具有抗体外和体内各种微生物的抗菌活性。特别是，无铁状态(apo型)的乳铁蛋白有抗革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌、Kleabsiela pnumoni和产气杆菌、产气微生物的抗菌活性，因为它螯合了铁离子，而这些铁离子是这些微生物必需的，于是抑制了这些微生物的生长。体外实验表明，乳铁蛋白有一种如同抗生素一样的在一个小时内抗99.99％的细菌例如杆状菌、大肠杆菌和沙门氏菌的有效的抗菌活性。乳铁蛋白也参与涉及铁结合作用的机制，以抑制微生物的生长，并且迅速地破坏细菌的生存能力。在这种机制中，乳铁蛋白不仅破坏革兰氏阴性细菌的外膜，以大量释放构成外膜的脂多糖，从而损坏膜的渗透屏障，而且增加微生物对疏水抗生素例如溶菌酶或利福平的敏感性，因而降低微生物对于抗菌素的抗性。尽管乳铁蛋白具有抗病原性微生物的作用，据说它并不具有抗有益于人体的细菌例如乳酸菌或Bifidus的抗菌作用。因此乳铁蛋白可保护新生婴儿抵抗细菌的感染。而且，在血液中还发现有少量的乳铁蛋白，由嗜中性粒细胞分泌。这种乳铁蛋白是嗜中性粒细胞的次级颗粒体的主要组成，而且在炎性反应时大量分泌。有些情况下，在活体中抗感染的病原微生物时，乳铁蛋白直接对溶菌酶或IgA具有增效作用。由于乳铁蛋白在抗感染的保护机制中起着重要的作用，不能在体内产生乳铁蛋白的患者在抗各种疾病的能力上严重恶化，增加感染细菌或真菌的可能。另外，乳铁蛋白在细胞增殖或铁的传送吸收方面起着中间介质的作用。技术背景尽管乳铁蛋白有各种前述功能，但是因为血液或其他体液中只含有少量的乳铁传递蛋白以及含有大量乳铁蛋白的初乳试样太少，许多研究都没有研究人乳铁蛋白。由于人乳是非常重要的，对乳铁蛋白进行仔细研究以利用基因工程方法建立关于在微生物中克隆和表达人乳铁蛋白(hLf)DNA的微生物的工业应用基础。但是，如上所述，除非制备出针对大肠杆菌的专门的重组质粒，在基因工程中，广泛使用大肠杆菌作为表达菌株来提取人乳铁蛋白(hLf)仍旧是困难的。鉴定所制备的重组乳铁蛋白的生物活性也是十分重要的，由于乳铁蛋白本身的抗菌活性，因此将一般的细菌或酵母作为宿主是非常不合适的，即使将它们作为宿主，由于可用的量太少对于工业生产也是不合适的。为了解决这个问题，Ward等(1992年)成功地采用真菌例如曲霉属Aspergillus indulans或米曲霉制备了重组乳铁蛋白。但是，依然存在很大的局限性，因为与在昆虫细胞中表达的乳铁蛋白相比，在真菌中表达的乳铁蛋白的量很少，只有5到25mg/l。况且，因为对于从真菌中产生的重组乳铁蛋白，仅仅在亲和性方面用Fe58标记的放射性同位素分析了其生物学活性，因此，重组乳铁蛋白是否实际上具有抗病原性微生物活性还存在疑问。同时，应用更高等动物的细胞来制备人乳铁蛋白的相关研究已被尝试，但因为涉及到培养过程的高额费用，其在这方面的应用是困难的。这样，在该领域内的研究者已经显示出通过应用昆虫细胞来大规模的生产人乳铁蛋白，从而将成本降为最低的兴趣。例如，应用昆虫细胞制备人乳铁蛋白的已有的报道(Salmon et al.，“Characterization of HumanLactoferrin Produced in the Baculovirus Expression System”inProtein Expr.Purif.，vol.9(2)，203-210，1997)然而，使用这种方法获得的人乳铁蛋白的量很少，只有15mg/l。据估计是由于人乳铁蛋白不能在昆虫细胞内连续分泌。而且，该方法中使用了5％的小牛血清，导致人乳铁蛋白的纯化质量低劣。为了克服上述问题，本专利技术提出了一种通过简单的途径大量制备人类乳铁蛋白的新方法以及重组人乳铁蛋白的生物活性的鉴定方法。因此，本专利技术的一个目的是提供一种采用昆虫细胞大规模制备人乳铁蛋白的方法本专利技术的另一个目的是提供一种用于制备人乳铁蛋白的重组昆虫细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种从昆虫细胞制备的重组乳铁蛋白的生物学鉴定方法。按照本专利技术使用昆虫细胞制备人乳铁蛋白的方法如附图说明图1、2的资料所示。采用昆虫细胞制备人乳铁蛋白的新方法包括如下步骤(a)将一个转移载体1与重组质粒phLf-82结合以制备重组表达载体pBacLf 3，该重组表达载体用载体pBacPAK中的多角体蛋白启动子修饰以实现对乳铁蛋白基因的调节；(b)在培养基中将该重组表达载体和一帮助载体pBacPAK6 4共转染进入昆虫细胞Sf95，以制备重组昆虫细胞Sf-Lf 6，并从重组昆虫细胞制备重组昆虫病毒；以及(c)从重组昆虫细胞Sf-Lf 6中制备人乳铁蛋白。在产生重组昆虫细胞的步骤中，将培养重组昆虫细胞的培养基离心分离，获得来自昆虫细胞的子代病毒。为了制备重组昆虫病毒，首先将转移载体1与重组质粒2结合以制备重组表达载体pBacLf 3，该重组表达载体被载体pBacPAK中的多角体蛋白启动子修饰以实现对乳铁蛋白的调节，并且在培养基中将重组表达载体与帮助载体pBacPAK 4共转染进昆虫细胞Sf9，从而制备重组昆虫细胞Sf-Lf6，从该细胞中制备重组昆虫病毒。最广泛使用的昆虫细胞是从军队蠕虫起源的秋粘虫(Sf9)。Sf9细胞系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过使用昆虫细胞来制备人乳铁蛋白的方法，包括下列步骤：（ａ） 将转移载体（１）和重组质粒ｐｈＬｆ－８（２）结合以制备重组表达载体ｐＢａｃＬｆ（３），该重组表达载体用载体ｐＢａｃＰＡＫ中的多角体蛋白启动子修饰以实现对乳铁蛋白基因的调节 ；（ｂ） 在培养基中将所述重组表达载体与一帮助载体ｐＢａｃＰＡＫ６（４）共转染进入昆虫细胞Ｓｆ９（５）以制备重组昆虫细胞Ｓｆ－Ｌｆ（６），并从所述重组昆虫细胞中制备重组昆虫病毒；以及（ｃ） 从所述重组昆虫细胞Ｓｆ－Ｌｆ（６）中制备人 乳铁蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李运万，常云喜，郭常喜，
申请(专利权)人：数位生物技术株式会社，韩晟化学株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]