一种新的血管发生抑制剂制造技术

本发明专利技术提供了一种新的血管发生抑制剂，ＬＫ６８，其氨基酸序列与人载脂蛋白（ａ）ｋｒｉｎｇｌｅ结构域ＩＶ３６，ＩＶ３７和Ｖ３８的一致，一种编码ＬＫ６８的ｃＤＮＡ序列，一种含有所述ｃＤＮＡ的重组表达载体，一种用所述重组表达载体转化的重组微生物，以及ＬＫ６８作为抗癌剂的新用途和治疗血管发生介导的疾病的方法。ＬＫ６８，ＬＫ６，ＬＫ７和ＬＫ８对培养的内皮细胞增殖和内皮细胞迁移表现抑制活性。ＬＫ６８和其单一ｋｒｉｎｇｌｅ还抑制鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）中毛细血管的正常发育。还显示ＬＫ６８的系统给药抑制原发性肿瘤生长，其与诱导肿瘤的血管发生的抑制有关。因此，ＬＫ６８蛋白，其单一ｋｒｉｎｇｌｅ或它们的功能等同物可以用于开发有效的抗癌剂，该抗癌剂对血管发生介导的疾病，包括癌症、类风湿性关节炎、牛皮癣、眼血管形成性疾病等高度有效。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及一种新的血管发生抑制剂，LK68，其氨基酸序列与人载脂蛋白(a)kringle结构域IV36、IV37和V38相同，更具体地说，本专利技术涉及一种LK68的氨基酸序列，编码LK68的cDNA序列，包含该cDNA的重组表达载体，用该重组表达载体转化的重组微生物，以及LK68作为抗癌剂的新用途，和治疗血管发生介导的疾病的方法。据报道血管生成过程的不平衡导致病理性疾病例如糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎和牛皮癣(参见Folkman，J.，Nature Med.，127-31，1995a)。尤其是原发性和转移性肿瘤都需要血管生成的血管恢复生长(参见Folkman，J.，New Engl.J.Med.，2851182-1186，1971；Folkman，J.，J.Biol.Chem.，26710931-10934，1992)。如果这种血管发生活性能够被抑制或消除，那么肿瘤即使存在，也将停止生长。一些报道表明，抑制肿瘤的血管发生可以提供一种长期控制疾病的可操作方法。阻断血管发生的阳性调控剂或应用阴性调控剂抑制血管发生导致实验肿瘤的延迟或抑制。如果这种血管发生活性能够被抑制或消除，那么肿瘤即使存在，也将停止生长。而且，在疾病状态，防止血管发生能够有效转移由于微血管系统的侵害造成的损害。因此，旨在控制血管发生过程的治疗会导致这类疾病的消除或缓解。因此，需要一种新的血管发生抑制剂，其能够抑制血管的不期望的生长，特别是生长成为肿瘤。含有血管发生抑制剂的抗癌剂应该能够抑制前转移性肿瘤中的内源性生长因子的活性，并防止肿瘤中毛细血管的形成，由此抑制肿瘤的生长。这种抗癌剂还应该能够调节其它血管发生过程，例如伤口愈合和生殖过程的毛细血管的形成。最后，这种抗癌剂和抑制血管发生的方法应该优选为非毒性的并产生较少副作用。迄今为止，本领域已经鉴定了至少10中内源性血管发生抑制物(参见O′Reilly，M.S.等，Cell，88277-285，1997)。这类分子中的一种是制管张素，其由血纤维蛋白溶酶原kringle I到IV构成(参见O′Reilly，M.S.等，Cell，79315-328，1994)。当系统应用时，制管张素有效抑制原发性肿瘤的生长和转移，且无毒性，同时也抑制由bFGF诱导的血管发生(参见O′Reilly，M.S.等，Nature Med.，2689-692，1996)。这些抗肿瘤作用伴随肿瘤块中微血管密度的显著降低，表明血管发生的抑制与肿瘤生长的抑制有关。Kringle是由大约80个氨基酸和三个分子内二硫键构成的蛋白质结构域。Kringle结构在一些蛋白质中发现，例如凝血酶原(参见Walz，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，741969-1973，1977)、血纤维蛋白溶酶原(参见Ponting，C.P.，Blood Coagul.&Fibrinolysis，3605-614，1992)、尿激酶(参见Pennica，D.等，Nature，301579-582 1983)、肝细胞生长因子(参见Lukker，N.A.等，Protein Eng.，7895903，1994)和载脂蛋白(＂apo＂)(a)(参见McLean，J.W.等，Nature，330132-137，1987)。这些结构域看起来是一种独立折叠单元，但它们的功能作用尚不清楚。以前的报道指出kringle结构能够作为血管发生过程中内皮细胞迁移和增殖的抑制剂。特别是凝血素的kringle 2和血纤维蛋白溶酶原的kringle 1-4、和5已经表明抗血管发生(参见Ji，W.R.等，FASEB J.，151731-1738，1998a；Ji，W.R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，247414-419，1998b；Cao，Y.等，J.Biol.Chem.，27129461-29467，1996；Cao，Y.等，J.Biol.Chem.，27222924-22928，1997；Barendsz-Janson，A.F.，J.Vasc.Res.，35109-114，1998；Lee，T.H.等，J.Biol.Chem.，27328805-28812，1998)。载脂蛋白(a)，一种具有kringle结构的蛋白质，是一种新的血管发生抑制剂的候选物。Apo(a)与apoB-100共价结合，是形成脂蛋白(a)的低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白成分(参见Fless，G.M.，J.Biol.Chem.，2618712-8718，1986)。脂蛋白(a)浓度的升高代表动脉粥样硬化的一种主要独立风险因素(参见Armstrong，V.W.等，Artherosclerosis，62249-257，1986；Assmann，G.，Am.J.Cardiol.，771179-1184，1996；Bostom，A.G.等，JAMA，276544-548，1996)。虽然已经报道了apo(a)的几种病原性活性，但其生理作用还未曾确定(参见Lawn，R.M.等，J.Biol.Chem.，27131367-31371，1996；Scanu，A.M.和Fless，G.M.，J.Clin.Invest.，851709-1715，1990；Utermann，G.，Science，2460904-910，1989)。Apo(a)含有两种类型的kringle结构域和一种无活性的蛋白酶样结构域前37个kringle结构域与血纤维蛋白溶酶原kringle IV有～75％等同性，最后kringle结构域与血纤维蛋白溶酶原kringle V有90％的等同性。有趣的是，kringle IV样结构域在不同的人的apo(a)基因的等位基因中存在15-40拷贝。从这一点上说，应用Apo(a)kringle结构研制一种肿瘤血管发生和生长的抑制剂是可行的。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种新的LK68蛋白，其由人apo(a)kringle结构域IV36，IV37和V38构成，以及编码LK68蛋白的cDNA。本专利技术的第二个目的在于提供一种新的重组载体，其含有编码人apo(a)kringle结构域IV36，IV37和V38的cDNA。本专利技术的第三个目的在于提供一种抗癌剂，其含有LK68蛋白或其单一kringle，LK6，LK7和LK8作为活性成分。本专利技术的第四个目的在于提供一种通过应用LK68蛋白治疗由血管发生介导的疾病的方法。图2是显示LK68对鸡绒毛尿囊膜(CAM)血管发生的抑制作用的照片。图3(A)是显示CAM中血管生长的抑制作用随LK68变化的图。图3(B)是显示CAM中血管生长的抑制作用随单一kringles，LK6，LK7，LK8和对照变化的图。图4(A)是显示重组LK68和制管张素对BCE细胞增殖的抑制作用的图。图4(B)是显示重组LK6，LK7和LK8对BCE细胞增殖的抑制作用的图。图4(C)是显示重组LK68和LK8对HUVEC细胞增殖的抑制作用的图。图5(A)是显示在存在重组LK68和LK8条件下，LLC细胞的BrdU标记指数的图。图5(B)是显示在存在重组LK68和LK8条件下，Y1细胞的BrdU标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＬＫ６蛋白（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４），由人载脂蛋白（ａ）ｋｒｉｎｇｌｅ结构域Ⅳ３６的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张志勋，金章性，朴恩正，廉晶善，郑守一，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]