表达唾液蛋白的转基因动物制造技术

本发明专利技术提供了基因组中包含用于蛋白质胃肠道特异性表达的转基因构建物的转基因动物。在优选的实施方案中，该蛋白质是植酸酶或其同源物。这些蛋白质可以是异源的，而且通过可操作连接编码该蛋白质的核酸序列与包括唾液腺蛋白质启动子／增强子的调控序列，可以在动物唾液腺中特异性表达。本发明专利技术还提供了使用这些核酸构建物来表达和生产蛋白质的方法。此外，本发明专利技术还提供了对这些蛋白质特异的抗体和免疫学诊断试剂盒。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因动物，更具体的说就是，涉及经遗传修饰表达期望蛋白质的动物。
技术介绍
磷对于所有有机体的生长而言都是必需的元素。在家畜生产中，磷缺乏已经成为全世界最普遍的矿物质缺乏，饲料中必须经常添加无机磷，由此获得期望的单胃动物(如猪、家禽、等等)生长性能。植酸或植酸盐(肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸二氢盐)是磷在谷类和豆类中的主要贮藏形式，占总磷含量的18％-88％(Reddy等人，1992)。植酸酶(肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)属于磷酸单酯水解酶类它催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解成无机单磷酸盐和肌醇的较低磷酸酯，或者在有些情况中是游离的肌醇。植酸酶根据酶攻击的第一个磷酸基团分为3-植酸酶或6-植酸酶。微生物中通常是3-植酸酶，而植物中通常是6-植酸酶(Cosgrove，1980)。在单胃动物中不存在植酸酶，或者以很低水平存在(Bitar和Reinhold，1972；Iqbal等人，1994)。因此，饮食中的植酸盐不被小肠消化或吸收，而是浓缩在粪便中，由此促成家畜生产密集地区的磷污染。来自畜牧场的排放物导致对江河的污染。这种排放物已经导致了江河中氧浓度的快速下降，这是由于水中过度的藻类生长所致，继而导致鱼和现存植物区系和动物区系的死亡率上升。由于猪和家禽生产的增加，这正成为全球化问题(Miner，1999；Mallin，2000)。此外，植酸被认为是抗营养因子，因为它与饮食中的必需矿物质和蛋白质发生相互作用，限制了谷类和豆类在人和动物中的营养价值(Harland和Morris，1995)。由于上述原因，已经进行了各种尝试，试图使动物能够利用饲料中可获得的植酸盐。这些尝试包括生产低植酸盐植物(Abelson，1999)、向动物饲料中添加植酸酶(Simons等人，1990)(Stahl等人，1999)、或转化饲料植物以产生需要的植酸酶(Pen等人，1993；Verwoerd等人，1995)。还测试了这些选项的组合，对接受低植酸盐玉米的家禽给予植酸酶(Huff等人，1998)。然而，这些解决方案增加了动物生产的成本。还因为植酸酶是一种酶，所以它易于因热度和湿气而失活，且在饲料粒化的高温下通常不稳定。用于补充动物饲料的植酸酶主要来自曲霉种；然而，大量的植物和微生物都产生植酸酶(Wodzinski和Ullah，1996)(Dvorakova，1998)。已经有报导说，由大肠杆菌产生的植酸酶展示所有报导中的最高活性(Wodzinski和Ullah，1996)。来自大肠杆菌的这种植酸酶最初以称为APPA的酸性磷酸酶基因而克隆(Dassa等人，1990)。Greiner等人(1991；1993)纯化了来自大肠杆菌的植酸酶，并报导说来自大肠杆菌的天然植酸酶的酸性磷酸酶活性的一些动力学特性与APPA编码的酸性磷酸酶相似。然而，作者并没有克隆植酸酶基因来证明它与APPA基因是相同的。我们随后克隆、过度表达、并分析了APPA基因，而且显示了大肠杆菌基因APPA编码双功能酶，其展示植酸酶和酸性磷酸酶活性(Golovan等人，2000)。植酸酶展示磷酸酶活性，然而酶之间的相对活性差异很大(Wodzinski和Ullah，1996)。因此，对能够使动物获得植酸酶从而能够有效进行植酸盐代谢由此降低磷污染的改进方法存在。在使用重组方法的蛋白质生产领域，相关问题之一涉及所需糖基化的缺乏。因此，还需要用于生产这些糖蛋白的方法。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术提供了体细胞和/或生殖细胞基因组中携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，该构建物包含编码蛋白质的转基因，所述转基因可操作连接用于在唾液腺中特异性表达蛋白质的第一种调控序列。在另一个实施方案中，本专利技术提供了体细胞和/或生殖细胞基因组中携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，该构建物包含编码植酸酶或其同源物的转基因。在还有一个实施方案中，本专利技术提供了用于表达蛋白质的方法，该方法包括下列步骤a)将转基因构建物导入非人动物胚胎，使得由胚胎发育而成的非人转基因动物具有包含转基因构建物的基因组，其中所述转基因构建物包含i)编码蛋白质的转基因，和ii)至少一种用于在胃肠道中特异性表达该蛋白质的调控序列，b)将胚胎转移至代孕雌性动物；并c)将胚胎发育成所述转基因动物，其中转基因在动物的胃肠道中产生的。在另外的实施方案中，本专利技术提供了经上文方法改造后表达蛋白质的转基因动物。本专利技术还提供了这种动物的后代。在另一个实施方案中，本专利技术提供了用于生产蛋白质的方法，包括下列步骤a)由非人转基因动物获得含蛋白质的唾液，该动物在其基因组中包含转基因构建物，其中所述转基因构建物包含i)编码该蛋白质的转基因，和ii)至少一种用于在唾液腺中特异性表达该蛋白质的调控序列，并b)由唾液提取蛋白质。在另外的实施方案中，本专利技术提供了用于在非人动物中表达植酸酶或其同源物的方法，所述方法包括a)构建包含转基因构建物的核酸序列，其中转基因构建物包含i)编码植酸酶或其同源物的转基因，和ii)至少一种用于在胃肠道中特异性表达蛋白质的调控序列，并b)用该核酸序列转染动物，由此，动物在其体细胞和/或生殖细胞基因组中携带转基因构建物，且动物在其胃肠道中表达植酸酶或其同源物。在另一个实施方案中，本专利技术提供了核酸分子，其所含核酸序列包含编码蛋白质的基因，该基因可操作连接至少一种用于在胃肠道中特异性表达该蛋白质的调控序列。在另一个实施方案中，本专利技术提供了对由上文的核酸序列表达的蛋白质具有特异性的抗体和用于免疫学检测这种蛋白质的测试试剂盒。本专利技术还提供了用于分泌这些抗体的杂交瘤。在另一个实施方案中，本专利技术提供了用上文的核酸序列转染的细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供了用于生产包含在唾液中分泌的、展示新的生理学活性的糖基化蛋白质的蛋白质分子的方法。这种活性的一个范例是植酸酶。图的简述在详细描述了下列附图之后，本专利技术优选实施方案的这些和其它特色将变得更加清晰附图说明图1是表示用于产生含可诱导的脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子的本专利技术基因构建物的方法的示意图。更具体的说就是，图1是例示用于产生转基因小鼠的转基因R15/APPA+内含子和R15/APPA的构建步骤的示意图。图2是表示用于产生含SV40启动子的本专利技术基因构建物的方法的示意图。更具体的说就是，图2是例示含通过转染导入哺乳动物细胞系的转基因SV40/APPA+内含子的质粒的构建步骤的示意图。图3是表示用于产生含组成性的腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子的本专利技术基因构建物的方法的示意图。更具体的说就是，图3是例示编码天然AppA植酸酶的转基因Lama2/PSP/APPA和编码含PSP信号肽序列的AppA植酸酶的Lama2/PSP/APPA的构建步骤的示意图。图4是含APPA转基因的Lama2-APPA质粒的示意图。图5例示含大肠杆菌APPA基因的Lama2/APPA质粒的核酸序列(SEQID NO1)。图6例示经转化小鼠的PCR结果。更具体的说就是，图6是例示来自使用Lama2/APPA构建物的XhoI和NotI片段产生的转基因雌性建立者小鼠3-1的第3代后代的尾部基因组DNA的APPA PCR产物的琼脂糖凝胶照片。第2代植酸酶基因阳性雄性与两本文档来自技高网...

【技术保护点】
体细胞和／或生殖细胞基因组中携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，所述构建物包含编码蛋白质的转基因，所述转基因可操作连接用于在唾液腺中特异性表达所述蛋白质的第一种调控序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CW福斯博格，S格罗万，JP菲利浦，
申请(专利权)人：圭尔夫大学，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]