通过缺失或消除非必需基因而减毒的重组副流感病毒疫苗制造技术

提供了重组副流感病毒（ＰＩＶ），其Ｃ、Ｄ和／或Ｖ的翻译读码框（ＯＲＦ）的表达降低或去除所产生的新的ＰＩＶ候选疫苗。通过改变一个重组ＰＩＶ基因组或反基因组而降低或消除Ｃ、Ｄ和／或Ｖ ＯＲＦ的表达，例如通过引入一个终止密码子，ＲＮＡ编辑位点的突变，改变由起始密码子定义的氨基酸的突变，或在靶ＯＲＦ中的移码突变。或者，Ｃ、Ｄ和／或Ｖ ＯＲＦ整体或部分缺失，使其编码的蛋白部分或完全地无功能，或同时完全破坏蛋白表达。Ｃ、Ｄ和／或Ｖ ＯＲＦ缺失或剔除突变体具有在疫苗发展中非常好的表型特征。这些缺失或剔除突变在产生的病毒或亚病毒颗粒中特定地导致产生一种或多种所需的表型。产生的候选疫苗在病毒生长特性、减毒、噬菌斑大小、和／或细胞病理学变化，以及其它新的表型上有所改变。还提供了存在于本发明专利技术Ｃ、Ｄ和／或Ｖ ＯＲＦ缺失或去除突变ＰＩＶ中的各种突变和核苷酸修饰，以获得良好的表型和结构效果。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
人副流感病毒3型(HPIV3)是幼儿和1岁以下儿童严重下呼吸道感染的一般诱因。它是仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的、导致该年龄段儿童因病毒性下呼吸道疾病入院的诱因(Collins等，p1205-1243，于B.N.Fields(Knipe等编辑)Fields Virology，3rded.，vol.1.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996；Crowe等，Vaccine 13415-421，1995；Marx，J.Infect.Dis.1761423-1427，1997)。该病毒的感染使3岁以下儿童发生显著病症。HPIV1和HPIV2是喉气管支气管炎(哮吼)的主要病因，也能引起严重肺炎和细支气管炎(Collins等，3rded.In“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus，Eds.，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在为期20年的长期性研究中，发现HPIV1、HPIV2和HPIV3分别占因呼吸道疾病入院总数的6.0、3.2和11.5％，三者的总和占入院总数的18％，因此，需要有效的疫苗。(Murphy等，Virus Res.111-15，1988)。也发现副流感病毒占儿童中并发中耳炎的、由病毒诱发的中耳积液诱因的很大比例(Heikkinen等，N.Engl.J.Med.340260-264，1999，在此引入作为参考)。因此，需要发展一种抗这些病毒的疫苗，以预防严重的下呼吸道疾病和伴随HPIV感染的中耳炎。尽管对发展抗HPIV的有效疫苗疗法进行了大量的研究，仍然没有获得任何HPIV株的被认可的疫苗制剂，以及改善HPIV相关疾病的被认可的疫苗制剂。目前，仅有两个活的减毒PIV候选疫苗受到了特别关注。其中之一是一种牛PIV(BPIV3)株，其与HPIV3抗原相关，并显示可保护动物免受HPIV3侵袭。BPIV3在人幼儿和儿童中减毒、遗传稳定，并且具有免疫原性(Karron等，J.Inf.Dis.1711107-14，(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.1721445-1450，(1995b))。第二个PIV3候选疫苗(JS cp45)是HPIV3 JS野生型(wt)株的冷适应突变体(Karron等，1995b，同上；和Belshe等，J.Med.Virol.10235-242，(1982))。这种活的、减毒的、冷传代(cp)的PIV3候选疫苗具有温度敏感(ts)、冷适应(ca)和减毒(att)的表型，在体内实验病毒复制后是稳定的。cp45病毒在实验动物中可保护性抵抗人PIV3的侵袭，并且在血清反应阴性的幼儿和儿童中是减毒、遗传上稳定并具有免疫原性的(Hall等，Virus Res.22173-184，1992；Karron等，1995b，同上)。近来，重组DNA技术促进PIV3候选疫苗的发展，使从cDNA中得到感染性负链RNA病毒成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-11358，1996)。文中报道了在必需病毒蛋白存在时，从cDNA编码的反基因组RNA中获得的一些重组病毒，这些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、猿猴病毒5(SV5)、新城疫病毒(NDV)和仙台病毒(SeV)(参见，如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBOJ.134195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.714272-4277，1997；Kato等Genes toCells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)1-6，1998；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；国际申请WO 97/06270；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；1997年7月15日的US专利申请08/892,403(相应于公布的国际申请WO 98/02530和之前的US临时申请1997年5月23日的60/047,634，1997年5月9日的60/046,141，1996年7月15日的60/021,773)；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Peeters等，J.Virol.735001-5009，1999；Jin等，Virology 251206-214，1998；Bucholz等，J.Virol.73251-259，1999；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；为各种目的在此分别全文引用作为参考)。在特别地有关于目前的专利技术的方面，近来发展了一种获得具有来自cDNA的wt表型的HPIV的方法，可回收感染性的重组PIV3 JS株(参见，如，Durbin等，Virology 235323-332，1997；1998年5月22目的美国专利申请09/083,793；1997年5月23日的美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO 98/53078)和1997年9月19日的美国临时专利申请60/059,385；在此分别引用作为参考)。此外，这些发现使可以进行cDNA克隆的遗传操作，以确定生物学突变体表型变化的遗传基础，如，在HPIV3 cp45中那些特定导致产生ts、ca和att表型的突变，以及BPIV3中那些特定导致产生其减毒表型的基因。此外，这些发现使可以构建新PIV候选疫苗，并估计其减毒、免疫原性和表型稳定性水平。因此，现在可从cDNA中获得感染性野生型重组PIV3(r)PIV3，以及其多种ts衍生物，并使用反向遗传系统产生具有确定的减毒突变的感染性病毒，以及研究现存疫苗病毒减毒的遗传基础。例如，发现在cp45 L基因中的三个氨基酸替代，单独或组合，特定导致产生ts和减毒的表型。其它ts和减毒突变存在于PIV3 cp45的其它区域。此外，利用PIV3 cDNA拯救系统本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的感染性重组副流感病毒（ＰＩＶ），包含一个ＰＩＶ基因组或反基因组、一个核壳蛋白（Ｎ）、一个磷蛋白（Ｐ）和一个大聚合酶蛋白（Ｌ），其中在所述基因组和反基因组中引入了一种改变，这种改变包含一个或多个Ｃ、Ｄ或Ｖ ＯＲＦ的部分或完全缺失，或使一个或多个Ｃ、Ｄ或Ｖ ＯＲＦ的表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：安娜P德宾，彼得L柯林斯，布赖恩墨菲，
申请(专利权)人：美国政府健康及人类服务部，
类型：发明
国别省市：US[美国]