衍生自牛脑的膜结合鞘磷脂酶,其分离方法和抗鞘磷脂酶单克隆抗体技术

公开了一种衍生自牛脑神经元膜的鞘磷脂酶，其分子量为６０ｋＤａ，活性是Ｍｇ↑［２＋］依赖性的，最适ｐＨ范围是６．０－９．０。其制备通过：牛脑组织匀浆，离心匀浆，除去细胞碎片和核；从上清液中将细胞膜作为沉淀通过离心分离出来；用含有硫酸铵的缓冲液处理该细胞膜沉淀，使鞘磷脂酶从膜上解离出来；对抽提液进行阴离子交换层析；层析组分在含有Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的缓冲液中超声，并对超声组分进行离心，获得含有鞘磷脂酶的上清液；以预定顺序对上清液进行疏水作用层析，阴离子交换高效液相层析，疏水作用高效液相层析和阳离子交换快速蛋白质液相层析，纯化了鞘磷脂酶。还公开了针对鞘磷脂酶，由杂交瘤ＳＭ１Ａ５（保藏号ＫＣＬＲＦ－ＢＴ－０００２５）产生的单克隆抗体。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,其分离方法和抗鞘磷脂酶单克隆抗体的制作方法
本专利技术涉及膜结合的，中性pH最适的鞘磷脂酶，其分离方法，和针对它的单克隆抗体。作为信号转导中的二级递质，神经酰胺涉及不同的细胞反应，包括细胞分化，细胞周期中止，细胞老化，凋亡等。神经酰胺的产生是鞘磷脂，一种膜磷脂水解的直接结果。鞘磷脂酶(SMase)的功能是将鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酸胆碱，其已发现的同工酶有脂质体酸性pH最适SMase(A-SMase)；细胞质，Zn-依赖性酸性pH最适SMase；碱性pH最适SMase；细胞质，Mg2+-依赖性中性pH最适SMase(N-cSMase)；和膜结合，Mg2+-依赖性，中性pH最适SMase(N-mSMase)。已知A-SMase和中性型SMase响应胞外刺激，如1α，25-二羟基维生素D3，肿瘤坏死因子-α，白细胞介素-1β，神经生长因子，化疗药物，血浆耗竭等，提高胞质神经酰胺的浓度。最近，已分离了衍生自人尿的酸性pH最适的SMase，并成功克隆了编码该酶的cDNA(Quintern，L.E.等，EMBO J.，8，2469-2473(1989))。本专利技术人也分离一种胞质75kDa N-cSMase，并确定了它的特征，该酶的活性依赖于Mg2+，并对谷胱甘肽和DTT敏感，其内容正在申请专利(韩国专利申请号98-28187)。当时，大部分N-mSMase还未被完全确定特征，因为它们的高疏水性，非常难于分离。尽管有这些困难，还是从哺乳动物细胞中克隆了一种分子量为47.5kDa的N-mSMase(Tomiuk，S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，3638-3643(1998))。然而，该N-mSMase虽然是一种膜结合蛋白质(可用Triton X-100解离)，但是被说成和TNF-α信号转导途径并无关系。用Triton X-100还从大鼠脑中成功分离了另一种N-mSMase，但是一种部分纯化的形式(Liu，B.，等，生物化学杂志，273，34472-34479(1988))。报道该部分纯化的N-mSMase的活性被谷胱甘肽(酶活性被抑制了50％的浓度(IC50)2.5mM)抑制，并被DTT和磷脂酰丝氨酸促进。本专利技术人成功的从牛脑中完全分离了两组新的N-mSMase一组分子量为35kDa，由4个同工酶构成(T-mSMase A、B、C和D)，使用Triton X-100分离；另一组分子量为40kDa，由两种同工酶构成(S-mSMase I和II)，使用硫酸铵分离，所有的酶都确定了特征，正在申请专利(韩国专利申请号98-28187)。特别是，据信脑组织中存在的N-mSMase在脑病原学中起了重要作用，因为脑组织中神经酰胺介导的信号转导途径导致神经细胞死亡，导致帕金森病和阿耳茨海默病，少突胶质细胞、PC12细胞和T9细胞的凋亡，所有都与低亲和性神经营养蛋白受体(p75NTR)的介导、TNF-α导致的少突胶质细胞凋亡，和某些中枢神经系统疾病，如缺血性脑损伤的病理学有关。专利技术简述因此，本专利技术的一个目的是提供一种从牛脑分离的，膜结合的，中性pH最适的鞘磷脂酶，它可用于开发大脑疾病，如帕金森氏病、阿耳茨海默病等的治疗剂。本专利技术的另一个目的是提供一种从牛脑制备该鞘磷脂酶的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种鞘磷脂酶特异性的单克隆抗体。根据本专利技术的第一个实施例，提供了一种衍生自牛脑神经元膜的鞘磷脂酶，它的分子量为60kDa，活性依赖于Mg2+，最适pH范围是6.0-9.0。根据本专利技术的第二个实施例，提供了一种根据本专利技术分离鞘磷脂酶的方法，包括步骤对牛脑组织匀浆，并离心匀浆，以除去细胞碎片和核；从上清液将细胞膜通过离心分离出来，成为沉淀；用含有硫酸铵的缓冲液处理细胞膜，以从膜解离出鞘磷脂酶；对抽提液进行阴离子交换层析；在含有Triton X-100的缓冲液中超声层析组分，并离心超声的组分，获得含有鞘磷脂酶的上清液；并对上清液按照确定顺序进行疏水作用层析，阴离子交换高效液相层析，疏水作用高效液相层析，和阳离子交换快速蛋白质液相层析，以纯化鞘磷脂酶。根据本专利技术的第三个实施例，提供了一种由杂交瘤SM1A5(保藏号KCLRF-BT-00025)产生的针对鞘磷脂酶的单克隆抗体。附图简述附图说明图1是对牛脑的硫酸铵抽提液进行DEAE-纤维素阴离子交换层析后作的层析图2是对阴离子交换层析获得的活性组分进行丁基-Toyopearl 650M疏水作用层析后作的层析图；图3是对疏水作用层析获得的活性组分进行DEAE-5PW阴离子交换HPLC后作的层析图；图4是对阴离子交换HPLC获得的活性组分进行苯基-5PW疏水作用层析后作的层析图；图5是对疏水作用HPLC获得的活性组分进行mono S阳离子交换FPLC后作的层析图；图6显示了阳离子交换FPLC获得的峰α(a)和峰β(b)的SDS-PAGE结果；图7显示了本专利技术鞘磷脂酶的免疫沉淀结果；图8显示了本专利技术的鞘磷脂酶蛋白质印迹分析结果；图9显示了Lineweaver-Burk图，其中鞘磷脂酶粘度的倒数对不存在表面活性剂(a)和存在0.1，1.0和2.0脱氧胆酸钠(b)时底物浓度的倒数作图；图10是本专利技术的鞘磷脂酶活性对Mg2+浓度作的图；图11是本专利技术的鞘磷脂酶活性对pH改变作的图；图12是本专利技术的鞘磷脂酶活性对Ca2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+和Cu2+浓度作的图；图13显示了本专利技术的鞘磷脂酶活性对GSH、DTT和2-巯基乙醇(a)和GSSG、半胱氨酸、半胱氨酸-甘氨酸和γ-戊二酸-半胱氨酸浓度作的图；图14显示了本专利技术的鞘磷脂酶活性对脱氧胆酸钠(a)和Triton X-100(b)的浓度作的图；和图15显示了从牛脑获得的神经元膜组分的SDS-PAGE结果。专利技术详述本专利技术涉及从牛脑的神经细胞膜中分离的膜结合蛋白，它具有将鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酸胆碱的酶活性。对于鞘磷脂，本专利技术的鞘磷脂酶显示高酶活性，具有47μM的Km，和1，587nmol/min/mg的Vmax，比用其它磷脂作为底物时的活性高50倍。除了依赖于Mg2+，鞘磷脂酶在pH范围为6.0-9.0时是活性的，最佳活性在pH7.5。另外，本专利技术鞘磷脂酶的活性受阳离子影响。虽然Cu2+，Zn2+和Fe2+都抑制酶活性(水解鞘磷脂)(IC50值分别为28μM、32μM和47μM)，Fe3+存在时酶活性提高了1.8倍。有趣的是，鞘磷脂酶的活性被Fe2+降低，而被Fe3+提高。能影响本专利技术的鞘磷脂酶活性的另一组化合物包括谷胱甘肽、氧化谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱氨酸-甘氨酸和γ-戊二酸-半胱氨酸。对于谷胱甘肽浓度，本专利技术的鞘磷脂酶显示两种不同行为。在谷胱甘肽浓度增至3mM时，鞘磷脂酶的活性增大。而另一方面，谷胱甘肽浓度在3mM以上继续增大时，鞘磷脂酶的活性减弱，而在谷胱甘肽浓度为10mM使，被完全抑制(IC50是8.0mM)。至于GSSG、半胱氨酸、半胱氨酸-甘氨酸和γ-戊二酸-半胱氨酸，它们每一种浓度的增加都导致鞘磷脂酶活性的降低。特别是，本专利技术鞘磷脂酶对谷胱甘肽损耗的敏感性比Liu的(Liu，B等，生物化学杂志，273，34472-34479(1998))部分纯化的N-mSMase大得多。相反，二硫苏糖醇和2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种衍生自牛脑神经元膜的鞘磷脂酶，其特征在于，该鞘磷脂酶分子量为６０ｋＤａ，活性是Ｍｇ↑［２＋］的，最适ｐＨ范围是６．０－９．０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金大敬，郑盛允，郑光默，
申请(专利权)人：金大敬，
类型：发明
国别省市：[]