构建融合文库的方法和组合物及该文库的用途技术

本发明专利技术提供了融合核酸文库，其中每个融合核酸都包括编码一个核酸修饰（ＮＡＭ）酶的核酸和编码一个候选蛋白质的核酸。本发明专利技术还提供了一个包括核酸修饰（ＮＡＭ）酶和候选蛋白质的融合多肽文库，以及一个表达载体文库，每个表达载体包括：（ｉ）包括编码一个核酸修饰（ＮＡＭ）酶的核酸和编码一个候选蛋白质的核酸的一个融合核酸，和（ｉｉ）一个ＥＡＳ。候选蛋白质中至少两个是不同的。优选ＮＡＭ酶是一个Ｒｅｐ蛋白。优选ＥＡＳ的长度超过２０个核苷酸。同样地，优选的实施方案采用的融合核酸包含编码表现结构的核酸、编码标记物的核酸或编码靶向序列的核酸。本发明专利技术也提供了核酸／蛋白（ＮＡＰ）结合物文库，每个ＮＡＰ结合物都包括一个含有ＮＡＭ酶和候选蛋白质的融合多肽。ＮＡＰ结合物也包括一个表达载体，该表达载体含有一个融合核酸和被ＮＡＭ酶识别的酶附着序列（ＥＡＳ），其中融合核酸包括含有编码ＮＡＭ酶的核酸和编码候选蛋白的核酸的融合核酸。ＥＡＳ和ＮＡＭ酶是共价结合的。本发明专利技术还提供了宿主细胞文库和筛选的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码NAM酶融合蛋白质的基因文库和识别目的核酸的使用方法。
技术介绍
DNA技术和生物信息学的改进使科学界能够获得一些微生物的天然基因组序列，同时高等真核生物和哺乳动物的基因组序列也接近完成。各种生物体DNA序列的迅速积累表现出巨大的潜在科学和商业机会。但是，在许多情况下，获得的天然序列不能翻译成它们所编码的生物、制药或工业方面有用的信息。因此，本领域需要有效地、系统地和尽可能地揭示天然和合成的DNA序列的功能和作用。揭示给定DNA序列潜在功能的几种普通方法已有报道。一种方法是依靠生物信息学工具，这也是发现基因和靶目标的基本方法。生物信息学软件可从几个专门从事将序列数据组织录入计算机数据库的公司获得。研究者能够将未定性的核酸序列与数据库中已知基因的序列相比较，由此就能提出关于核酸序列编码的基因产物的功能的理论。但是，生物信息学软件很昂贵，通常需要为有效使用而进行大量的训练，且仅能使研究者推测一个编码的基因产物的可能功能。此外，越来越多的DNA序列经过鉴定发现与已知功能的基因之间没有序列上的联系，而且对于许多所谓“已知”的基因也发现了许多新的特性。因此，生物信息学只提供了有限的信息，必须谨慎使用。所有信息学预测的特性需要实验证实。另一个关联序列数据与功能的方法是对单个基因功能进行试验性的检测。在以前描述的方法中，核酸序列采用许多表达构建物的任何一种来表达以获得一个编码的肽，然后经过检测来鉴定具有所需特性的肽。许多以前描述的方法中固有的难点是将目标特性与其编码核酸序列联系起来。换句话来说，当将大量的核酸和肽序列及其探明的编码功能集中在一起时，就越来越难鉴定和分离具有所需功能的编码序列。通过将表达的肽和编码它的遗传物质连接起来缓解了与处理大量核酸序列集，如基因文库相关的主要难题。一个将肽与其编码核酸联系起来的方法是使用多核糖体显现。多核糖体显现方法主要包括在体外翻译RNA，并将新生蛋白复合到其相应的RNA上。复合体是通过控制编码序列来构建的，这样核糖体就不会释放新生蛋白或RNA。通过回收目标蛋白，研究者可以获得相应的RNA，因此经已知的方法如逆转录酶结合PCR将RNA转变成DNA后，就可以获得编码的DNA序列。然而，多核糖体显现的方法只能在体外进行，操作困难，且需要无核酶的环境。由于体外翻译机制的起始蛋氨酸密码子替换和较少完整进程的性-质，这种方法不适用于大的蛋白。另外，RNA-蛋白-核糖体复合体是不稳定的，因此限制了适合多核糖体显现复合体所用的筛选方法和工具。另一个采用基因文库连接蛋白和编码核酸分子的常用方法涉及在细胞、病毒、噬菌体和酵母的外表面上显现蛋白。例如通过将变异蛋白表达为病毒包被蛋白的一个成分，蛋白自然与其在病毒颗粒或细胞宿主内的编码DNA相连接，这可以容易地进行分离。然后纯化和分析该DNA。其他在基因文库构建物内连接蛋白和DNA分子的系统也有描述，如国际专利申请WO93/08278，WO98/37186，和WO99/11785。然而，这些方法具有一些不是最需要的特性。首先，表达的蛋白和相应的cDNA是非共价结合的。得到的复合体不稳定或不适合许多筛选步骤。其次，设计的显现系统局限于体外或原核异种表达系统，它们不能提供研究真核肽所必须的蛋白修饰或折叠机制。不正确折叠或修饰的蛋白经常缺乏所需蛋白的天然功能，且通常非常不稳定。第三，如果在一个生物微粒的表面显现，表达的蛋白经常要经历显现系统固有的不需要的生物选择。例如，在细菌性病毒，如噬菌体上显现蛋白时，表达的蛋白将组合为细菌病毒包被蛋白的一部分，并在细菌病毒的表面上显现。细菌病毒结合的变异蛋白与周围环境的相互作用以及蛋白整合细菌病毒被膜，可损害变异蛋白的构型和活性。而且，即使蛋白整合到细菌病毒的衣壳中，显现的蛋白也可能不具有活性所需的正确的几何或化学计量形式。第四，使用生物微粒构建大型表面显现文库需要大量的时间，且研究者必须小心以确保生物微粒，如病毒或噬菌体，保持存活。第五，已知不同的宿主在进行蛋白翻译时，具有不同的密码子选择倾向。例如，在原核系统，用于细菌病毒显现的表达系统中，至少有五个通常可在哺乳动物细胞中识别的密码子在蛋白翻译过程中不容易被细菌所识别。因此具有这些密码子的哺乳动物序列在细菌中不能被翻译或翻译效率非常低，引起明显的阴性筛选结果。鉴于以上的观点，在本领域仍然需要一个基因文库和使用的方法，该文库可使一个变异或未知肽很容易地与其编码序列相联系。本专利技术就提供了这样的文库和方法。另外，本专利技术可在天然细胞环境中鉴定相关的蛋白，这是采用真核系统的一个明显的优势。从此处提供的专利技术描述中，本专利技术的这些和其他优势，以及附加的专利技术特性是显而易见的。专利技术概述根据在本文概括的目的，本专利技术提供了融合核酸的文库，每个融合核酸包含编码核酸修饰(NAM)酶的核酸，和编码候选蛋白的核酸。候选蛋白中至少有两个是不同的。在一个优选的实施方案中，NAM酶是一个Rep蛋白。同样，优选的实施方案采用了融合核酸，该融合核酸由编码表现结构的核酸、编码标记物的核酸或编码靶向序列的核酸组成。在另外一个实施方案中，本专利技术提供了融合多肽文库，每个融合多肽包括NAM酶和候选蛋白，其中候选蛋白中至少有两个是不同的。在一个优选的实施方案中，NAM酶是一个Rep蛋白。同样地，优选的实施方案采用融合多肽，该融合多肽由表现结构，标记物或靶向序列组成。在另一个实施方案中，专利技术提供了表达载体的文库，每一个表达载体包括一段融合核酸，该融合核酸由编码NAM酶的核酸、编码候选蛋白的核酸和可被NAM酶识别的酶附着序列(EAS)。候选蛋白中至少有两个是不同的。在一个优选的实施方案中，NAM酶是一个Rep蛋白。同样地，优选的实施方案采用融合核酸，该融合核酸由编码表现结构的核酸、编码标记物的核酸或编码靶向序列的核酸组成。一个优选的实施方案也采用包含至少20个核苷酸的EASs。在一个另外的实施方案中，本专利技术提供了核酸/蛋白(NAP)结合物的文库，每个结合物含有包括NAM酶和候选蛋白的融合多肽。NAP结合物也包括一个表达载体，该载体包括一段融合核酸和一段可被NAM酶识别的酶附着序列(EAS)，融合核酸包括含有编码NAM酶的核酸和编码候选蛋白的核酸的融合核酸。EAS和NAM酶是共价结合的。候选蛋白中至少有两个是不同的。在一个优选的实施方案中，NAM酶是一个Rep蛋白。同样地，优选的实施方案采用融合核酸，该融合核酸包括编码表现结构的核酸、编码标记物的核酸或编码靶向序列的核酸。一个优选的实施方案也采用包含至少20个核苷酸的EASs。本专利技术还进一步提供了含有本专利技术组成成分的宿主细胞。在另外一个方面，本专利技术提供了真核宿主细胞文库，每个文库包含一个表达载体，该载体含有一段融合核酸和一个可被NAM酶识别的酶附着序列(EAS)，所述的融合核酸包括编码NAM酶的核酸和编码候选蛋白的核酸。候选蛋白中至少有两个是不同的。在一个优选的实施方案中，NAM酶是一个Rep蛋白。同样地，优选的实施方案采用融合核酸，该融合核酸包括编码表现结构的核酸、编码标记物的核酸或编码靶向序列的核酸。一个优选的实施方案也采用包含至少20个核苷酸的EASs。在另一个方面，本专利技术提供了真核宿主细胞文库，每个文库包含一个核酸/蛋白(NAP)结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合核酸文库，每一个融合核酸包括：ａ） 编码Ｒｅｐ蛋白的核酸；和ｂ） 编码候选蛋白的核酸；其中至少两个所述的候选蛋白是不同的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李民，
申请(专利权)人：约翰斯霍普金斯大学医学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]