表达免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒的制备制造技术

提供了表达一种或多种免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）。该重组病毒通过添加或替代编码免疫调节分子（优选细胞因子）的多核苷酸序列而修饰。细胞因子的增加、降低，或增强了病毒生物学和／或对ＲＳＶ的宿主免疫应答的一些方面，使该病毒更便于用做疫苗。本发明专利技术使用的细胞因子包括但不局限于：白介素２（ＩＬ－２），白介素４（ＩＬ－４），白介素５（ＩＬ－５），白介素６（ＩＬ－６），或白介素１８（ＩＬ－１８），α肿瘤坏死因子（ＴＮＦ），γ干扰素（ＩＦＮ），和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）。多核苷酸或免疫调节分子优选地添加或替代到该重组病毒基因组或反基因组，典型地在基因间隔区或其它非编码位点，作为一个单独基因，也可以其它形式，如作为融合蛋白表达。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
人呼吸道合胞病毒(HRSV)是世界范围内严重儿科呼吸道疾病的首要病因(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；在此引用作为参考)。RSV是超过所有其它病毒的诱发1岁以下幼儿肺炎和细支气管炎的病原。几乎所有的儿童在两岁时都被感染，再次感染以可观的频率发生于较大的儿童和青年中(Chanock等，于ViralInfection of Humans，3rded.，A.S.Evans，ed.，Plenum Press，N.Y.，1989；在此引用作为参考)。因呼吸道疾病引起的儿科入院的五分之一是由RSV引起的，并且仅在美国每年造成10万例入院和4,500例死亡(Heilman等，J.Infect.Dis.161402-6，1990；在此引用作为参考)。此外，有证据表明生命早期的严重呼吸道感染可以引发或恶化哮喘(Sigurs等，Pediatrics 95500-505，1995；在此引用作为参考)。尽管RSV通常被认为感染儿童群体，也发现它是较老的人中严重疾病的重要诱因(Falsey等，J.Infect.Dis.172389-394，1995；在此引用作为参考)。RSV也在某些无免疫应答的个体(如骨髓移植受体)中引起威胁到生命的疾病(Fouillard等，Bone Marrow Transplant 997-100，1992；在此引用作为参考)。现在有一种化学治疗试剂，病毒唑，可以治疗RSV。但其疗效和应用是有争议的。也有干扰RSV的已注册的产品，由一个供体IgG池(Groothuis等，N.Engl.J.Med.3291524-1530，1993；在此引用作为参考)或人源化RSV特异的单克隆抗体组成。这些是作为被动免疫预防试剂给药高危险个体。尽管这些产品有作用，其高成本和其它因素(如缺乏长期的有效性)使其不适合广泛的使用。其它不利之处包括传播由血液运载的病毒的可能性和制备和储存的难度和花费。此外，对该感染性疾病控制的历史，以及特别是病毒起源的疾病，表明疫苗的首要重要性。尽管多年以来对发展抗RSV的有效疫苗制剂进行了研究，仍然没有安全和有效的疫苗被认可，以预防与RSV感染相关的严重疾病和显著的死亡率。难以发展成功的疫苗与这一事实部分相关，即，小的幼儿对RSV抗原的血清和分泌性抗体应答较低。因此，RSV对这些个体的感染更严重，而累积性免疫似乎保护更年长的儿童和成人，以抗该病毒更严重的冲击。RSV感染中的免疫机制近来成为研究焦点。分泌性抗体在保护上呼吸道中似乎最重要，而高水平血清抗体被认为抗RSV在下呼吸道的感染中起主要作用。RSV特异的细胞毒T细胞，诱导免疫的另一个效应方面，对解决RSV的感染也重要。不过，尽管后一个效应物可因先前的免疫而增强，对病毒攻击有增强的抗性，但这种效应是短期的。F和G表面糖蛋白是RSV的两个主要保护性抗原，也是RSV中仅有的诱导RSV中和抗体和对抗攻击长效抗性的蛋白(Collins等，FieldsVirology，Fields等，eds.，21313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia，1996；Connors等，J.Virol.65(3)1634-1637，1991；在此引用作为参考)。第三个RSV表面蛋白，SH，不诱导RSV中和抗体和对RSV攻击的显著抗性。发展活RSV疫苗的一个阻碍是难以在减毒和免疫原性之间获得一种适当的平衡。其它阻碍包括一些减毒病毒遗传不稳定、RSV在细胞培养时相对低的生长和病毒颗粒的不稳定。此外，天然感染诱发的免疫不能充分抗后来的感染。许多因素可能引起这种现象，包括免疫系统对限制呼吸道腔表面病毒感染相对的低效，局部粘膜免疫的短期性，快速和广泛的病毒复制，由于免疫不成熟而在幼儿中降低的免疫应答，经胎盘来源的母体血清抗体引起的免疫抑制，和病毒的某些特点，如G蛋白高水平的糖基化。RSV也作为两个抗原亚型A和B出现，如下所述，抗一个亚型的免疫对于另一个的有效性下降。尽管RSV在生命中可以多次感染，由于先前感染诱导的保护性免疫的存在，再次感染的严重性降低，因此免疫预防是可行的。可以鼻内给药一种活的减毒RSV疫苗以引发轻度的免疫性感染。与肠胃外给药途径相比，这种方式的优点是简单和安全。这也直接刺激在抵抗RSV中起主要作用的局部呼吸道免疫。这也消除了RSV-特异的母体来源的血清抗体的免疫抑制(典型的发现于幼儿中)效果。RSV抗原肠胃外给药有时与免疫病理并发症相关(Murphy等，Vaccine 8(5)497-502，1990；在此引用作为参考)，而用活病毒从未发现这种情况。二十世纪六十年代中期，一种福尔马林灭活的病毒疫苗被检测为抗RSV，但不能抗RSV感染或疾病，事实上，在之后的病毒感染时症状更加恶化(Kim等，Am.J.Epidemiol.89422-434，1969；Chin等，Am.J.Epidemiol.89449-463，1969；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.89405-421，1969，在此引用作为参考)。更近一些的RSV的疫苗发展聚焦于减毒的RSV突变体。Friedewald等报道了一种冷传代型RSV突变体(cpRSV)(J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968；在此引用作为参考)，其足够地减毒从而可以作为疫苗使用。这种突变体与其野生型(wt)亲本病毒相比，表现在26℃略微增加的生长效率，但其复制并非温度敏感或显著的冷适应的。但这种冷传代的突变体在成人中是减毒的。尽管其在先前感染了RSV的幼儿和儿童(即，血清反应阳性个体)中具有满意的减毒和免疫原性，这种cpRSV突变体在血清反应为阴性的幼儿上呼吸道中保持低水平的毒性。同样的，Gharpure等报道分离出一种温度敏感RSV突变体(tsRSV)(J.Virol.3414-421，1969；在此引用作为参考)，其也是有前途的候选疫苗。一个突变体，ts-1，被广泛地在实验室和志愿者中检测。该突变体在成人志愿者中产生无病症的感染，也赋予对免疫45天后野生型病毒攻击的抗性。尽管血清反应阳性的幼儿和儿童经历无病症的感染，血清为阴性的幼儿却发展出鼻炎和其它轻微症状。此外，也发现了这种ts表型的不稳定性。尽管表现显示部分或完全的温度敏感性丧失的病毒代表从接种者可回收的病毒的一小部分，其除了轻微鼻炎外不引起其他疾病症状。这些和其它研究表明某些冷传代和温度敏感RSV株减毒不足，因此可在一些受接种者，特别是血清反应阴性幼儿中引发疾病的轻微症状，而另一些过分减毒，不能足量复制以诱导保护性免疫应答(Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；在此引用作为参考)。此外，候选疫苗突变体的遗传不稳定性导致其温度敏感表型的丧失，进一步阻碍了发展有效的RSV疫苗。一般参见(Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974；McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696，1974；Belshe等，J.Med.Virol.3101-110，1978；在此引用作为参考)。作为活减毒RSV疫苗的替代，研究者还用纯化的RSV包膜糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的感染性呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ），包含重组ＲＳＶ基因组或反基因组，核壳蛋白（Ｎ）、核壳磷蛋白（Ｐ）、大聚合酶蛋白（Ｌ）和ＲＮＡ聚合酶延伸因子，其中该重组基因组或反基因组掺入了编码一种免疫调节分子的异源多核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：彼得L柯林斯，亚历山大布克列耶夫，布赖恩R墨菲，斯蒂芬S怀特黑德，
申请(专利权)人：美国政府健康及人类服务部，
类型：发明
国别省市：US[美国]