大蹼铃蟾铃蟾肽及其制备方法和其基因技术

本发明专利技术涉及大蹼铃蟾铃蟾肽及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。其铃蟾肽为从中国两栖类动物大蹼铃蟾（Ｂｏｍｂｉｎａ ｍａｘｉｍａ）皮肤分泌物中分离得到的由１６个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量１８８７，等电点１０．６，多肽氨基酸全序列一级结构为：ｐＥＫＫＰＰＲＰＰＱＷＡＶＧＨＦＭ－ＮＨ↓［２］。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码大蹼铃蟾铃蟾肽基因核苷酸序列由ｃＤＮＡ由５２２个核苷酸组成，其中编码成熟大蹼铃蟾铃蟾肽为第１７３－２２０位核苷酸。其基因作为基因工程制备铃蟾肽的应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)铃蟾肽及其制备方法和其基因，属生物医学领域。铃蟾肽(bombesin)是一类神经内分泌多肽，具有广泛而复杂的生物学效应，主要包括3方面的生理功能神经递质，促激素和有丝分裂原。其最显著的生理功能是作用于大脑孤束核而引起食欲减退。目前在国际上已经被用于研究和开发减肥药物。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而被广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药专利技术的热点。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景。专利技术人将本专利技术的大蹼铃蟾铃蟾肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽，与从欧洲铃蟾(Bombina bombina)皮肤中得到的铃蟾肽有8个氨基酸的差异，专利技术人将本专利技术的铃蟾肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。本专利技术的目的是基于上述现有技术基础，提供一种用于开发减肥药物的大蹼铃蟾铃蟾肽及其制备方法和其基因。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案大蹼铃蟾铃蟾肽，为我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到铃蟾肽，它由16个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量1887，等电点10.6，多肽氨基酸全序列一级结构为焦谷氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-色氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-酰胺化甲硫氨酸(pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH2)。大蹼铃蟾铃蟾肽的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，分子筛凝胶过滤分离，收取所得峰V再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第二步HPLC反相C18柱层析分离出的峰(箭头所示)即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，N-端氨基酸用焦谷氨酸酶处理后再用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。大蹼铃蟾铃蟾肽用于药物制备的应用。大蹼铃蟾铃蟾肽基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，在欧洲铃蟾铃蟾肽信号肽核苷酸序列的基础上设计引物，利用PCR方法筛选铃蟾肽基因。根据信号肽序列所设计的扩增引物LR126，其长度为22个核苷酸，其序列为5’ATGTCTGCGATTCCTCTGAACA3’，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码大蹼铃蟾铃蟾肽的基因由522个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为CTCAGACTCTCACAGCTCTGCGGTACTCACAGCTTTAGACATGTCTGCAATTCCTCTGAACAGGATCCTGCCTCTAGGGTTCCTATTTTGCCTGCTTCTTTCCTCCTTCATTTCTCTGTCCAGCTGCATGGAGTTCGTTGAAGATGCCAACAATCAGGGCAGAATCAGCCTGCAGAAGAAGCCACCCCGGCCACCCCAGTGGGCAGTGGGTCACTTCATGGGTAAGAAGAGCCTGCAAGACATGGACTTTGAAGAGATGGGAAGTTTTGCTAAACGTAGCGTTGAGAAGATTAGAGCTGCTCTCCTGCAAGAGCAGCAAGGAGCAGGATCAGAAAGAGAGCTGCGGCATGCACAGTTGGTAGCAAGGGAGATCTTGGCGCAGTATCTGGAGAATATGCAGAATTAGCAAAGAAATGTTTCCTCCTGTACATACAGAAATATAAATAAATATATTTGTGCCTGAGATATGGGACTTATTTTACACATTCCAAAAGTTTATTGTTTACAAAAAAAAAAAAAAAA其中编码成熟大蹼铃蟾铃蟾肽为第173-220位核苷酸，其氨基酸序列为pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH2(pE为焦谷氨酸)大蹼铃蟾铃蟾肽基因作为基因工程制备铃蟾肽的应用。下面结合附图用实施例来进一步详述本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。附图说明图1为本专利技术大蹼铃蟾铃蟾肽的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。图2为本专利技术大蹼铃蟾铃蟾肽的HPLC反相C18柱层析图。图3为本专利技术大蹼铃蟾铃蟾肽基因核苷酸序列。图4为本专利技术成熟大蹼铃蟾铃蟾肽氨基酸序列。实施例一1，制备大蹼铃蟾铃蟾肽活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。第一步SephadexG-50凝胶过滤按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液，上样品于经0.1MNa2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的SephadexG-50凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液洗脱，收集峰V。第二步，反相高压液相层析(RP-HPLC)SephadexG-50凝胶过滤得到的峰V以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰(箭头标记)即大蹼铃蟾铃蟾肽。2，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油间硝基苄醇二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Ky。3，纯化的大蹼铃蟾铃蟾肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，等电本文档来自技高网...

【技术保护点】
大蹼铃蟾铃蟾肽，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由１６个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量１８８７，等电点１０．６，多肽氨基酸全序列一级结构为：焦谷氨酸－赖氨酸－赖氨酸－脯氨酸－脯氨酸－精氨酸－脯氨酸－脯氨酸－谷氨酰胺－色氨酸－丙氨酸－缬氨酸－甘氨酸－组氨酸－苯丙氨酸－酰胺化甲硫氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，赖仞，刘衡，李文辉，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]