提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法技术

本发明专利技术涉及的提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法：在对传统的ＭＳ培养基进行改进后，再加入单一／混合稀土元素化合物，所述单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物，减少或替代培养基中ＮＡＡ、６－ＢＡ激素，在这种培养基对青蒿器官进行固体或液体培养，可大幅度提高培养物生物量和青蒿素含量，解决青蒿素生产中青蒿资源匮乏的难题，提高青蒿素的产量，降低青蒿素生产成本。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化工程技术中植物器官的培养方法，特别涉及一种。青蒿素是含有过氧基团地倍半萜内酯，分子式为C15H22O5。它对脑型及抗氯喹恶性疟疾有特殊疗效。世界市场青蒿素主要来源于中国和越南，由于受气侯、种质退化等多种因素影响，远远不能满足对青蒿资源的要求。利用植物组织、器官培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的热点之一，自80年代以来，对植物组织、器官培养生产青蒿素已进行了较多的研究。已经在青蒿愈伤组织、悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进行了青蒿素合成的探索。采用青蒿器官(毛状根和丛生芽)大规模培养将成为解决青蒿素生产中青蒿资源匮乏的有效途径之一，但传统的青蒿器官培养方法，由于所培养的青蒿器官的生物量和青蒿素含量较低而使得青蒿素生产成本高居高不下，限制了青蒿素的生产。研究表明，在未分化的青蒿植物组织中不含或含有极低水平的青蒿素，而一定的组织分化则可促进青蒿素的合成。在对青蒿的愈伤组织、带芽的愈伤组织和由愈伤组织分化产生的小植株中青蒿素合成的分析，可以得出青蒿愈伤组织中不含青蒿素，在愈伤组织伴随芽分化形成时，检测到青蒿素的含量约为干重的0.008％，而在分化苗长成的植株中青蒿素的含量达到干重的0.92％，高于野生植株(贺锡纯等，植物学报，1983，25，87-90.)；在进行青蒿愈伤组织悬浮培养时，在愈伤组织中未检测到青蒿素的存在，但在悬浮培养液中检测到微量的青蒿素(8ug/mL)(Nair MSR，et al，J.Nat.Prod.，1983，49，504-507.)。同样在Brown(Brown G D，J.Nat.Prod.，1994，57，975～977.)的研究中也证实了青蒿的愈伤组织中不含萜类，但在分化的芽中检测到和亲本相似的萜类合成物。在研究青蒿悬浮细胞培养时，在培养物中没有检测到青蒿素的合成，但在培养液的正己烷提取物中检测到抗疟的活性(Tawfiq N K，et al，Plant cell Rep.，1989，8，425～428.)。在新诱导的青蒿愈伤组织中检测到青蒿素的含量约为干重的0.1-0.08％，此培养物经三次继代培养后，愈伤组织内青蒿素的含量几乎难以检测到(Paniego N B，et al，Plant Cell Tiss.Org.Cult.，1994，36，163～168.)。通过青蒿器官生长及代谢产物合成过程调控，利用转基因植物均可能显著提高青蒿素含量，增加青蒿素产量。诱导的青蒿芽培养物中可检测到青蒿素的存在，并对营养物和激素对青蒿芽生长和青蒿素的影响进行研究，发现赤霉素和水解酪蛋白等对芽中青蒿素的合成具有强的刺激作用(Woerdenbag H J，et al，PlantCell Tiss.Org.Cult.，1993，32，247～257.)。转基因的青蒿芽培养物中其青蒿素含量稳定，约为干重的0.02％，改进培养基中的各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的合成影响不明显，但添加赤霉素使得芽中青蒿素的含量提高了3～4倍(Paniego N B，et al，Enzyme Micro.Tech.，1996，18，526～530.)。用发根农杆菌1601成功转化青蒿幼茎获得毛状根培养物，提供了以发根农杆菌作为基因载体进行青蒿的遗传改造的可行性(秦明波等，植物学报，1994，36，165～170.)。同时，利用发根农杆菌15834感染青蒿的芽尖和叶片，获得青蒿毛状根培养物，并且检测到青蒿素的含量约为干重的0.43％，其含量远高于其它青蒿组织培养物中青蒿素的含量(Weathers P J，et al，Biotechnol.Lett.，1994，16，1281～1286.)。利用发根农杆菌1601感染青蒿叶片建立了毛状根培养系，并在培养物中检测到青蒿素，在添加赤霉素的条件下青蒿素的含量约为干重的0.2％(蔡国琴等，生物工程学报，1995，11，315～320.)。利用根癌农杆菌感染青蒿叶片，获得转基因植株中青蒿素含量约为干重0.17％，青蒿素合成前体青蒿素B的含量约为0.22％(Vergauwe A，et al，Plant Cell Rep.，1996，15，929～933.)。但以上青蒿组织的培养方法都存在着所得青蒿器官生物量和青蒿素含量比较低的缺陷，严重地限制了青蒿素的生产。某些稀土元素在适宜的浓度下具有植物细胞、组织及器官快速生长和次生代谢产物合成所需的多种生理功能，如可提高光合作用效率，促进组织分化以及对营养物的吸收利用等；不同的稀土元素在植物中所起到的作用不同，只有轻稀土中的部份元素，如镧、铈、钕、镨、钐、铕等，能促进植物生长；相反，有的重稀土元素，如钇等，甚至具有遗传毒性(芳能虎，何友昭，赵贵文，稀土元素的植物生理作用研究进展，稀土，1998，19(5)66-70)；适宜浓度的稀土化合物对植物生长具有刺激促进作用，但不同的稀土元素对植物生长的影响不同。低浓度的稀土元素能促进种子萌发、生根及植株生长，其生理作用机制一般认为与酶有关(杨家朴、张淑媛。稀土元素对起稿小麦抗逆性的初步研究。中国稀土学报，1986，4(4)67)。尽管稀土本身是否属于植物必须营养元素这一点尚未得到确证，但许多研究已表明稀土元素在一定条件下确有促进植物对养份的吸收、转化和利用等生理活性；稀土元素对植物体内营养代谢也有明显的促进作用；一些研究认为，稀土离子能取代Ca2+在细胞膜上的位置，这对维持细胞膜的稳定性及对养分的吸收、运转均起了一定的促进作用；但高浓度稀土元素会破坏细胞膜的稳定性，使膜通透性增大，造成细胞质内K+等营养离子流失，植物营养代谢受阻；稀土元素对植物的光合作用有明显的影响，但同时亦证明高浓度稀土对植物光合作用有抑制作用；一定浓度的稀土可促进植物PSII蛋白复合体活性及光电子传递的速率，从而促进光能转换和光化学反应过程；高浓度稀土的抑制作用可能是因为稀土离子在与Mg2+发生竞争吸附而取代Mg2+，以致影响叶绿素的合成；稀土元素对植物的抗逆性也有一定影响，可以提高植株的保水和耐高温能力，还能增强植物的抗病能力；高浓度稀土能促使植物气孔关闭，抑制蒸腾作用，从而降低植物的代谢活动或使其失调。高浓度稀土可与ATP形成络合物，从而抑制己糖激酶的催化反应而使糖酵解受阻，导致体内可溶性糖增加，质膜通透性增大，电解质和细胞质外渗，从而降低和破坏植株的抗逆抗病能力；稀土元素在植物生长中的生理作用已逐渐引起了植物细胞工程人员的重视，也进行了一定的研究，如在长春花细胞悬浮培养的前指数期加入硝酸镧无论对细胞的生长和次生代谢物的积累均有促进作用(元英进，胡宗定，稀土元素对长春花植物细胞培养的影响，稀土，1993，14(3)38-40)；La3+在墨兰根状茎细胞器的发育过程中是通过膜上受体产生第二信息后调节其发育(罗虹，陈汝民，La3+对墨兰根状茎某些细胞器发育的影响，热带亚热带植物学报，1996，4(3)56-59)；在红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇中，镧、铈的加入能明显改变细胞生长模式，而且有利于紫杉醇的合成和释放(元英进，胡国武，王传贵，等，镧、铈对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成与释放的影响，中国稀土学报，1998，16(1)56-60)；在发菜细胞培养中加入镧不但能促进其生长，而且还改变了氨基酸含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法，其特征在于，步骤如下：（１）配制液体或固体培养基：Ａ．液体培养基配制：在ＭＳ液体培养基中添加２０－５０ｇ／Ｌ的蔗糖，０或０．５ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，０或０．０５ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ；再加入含单 一或混合稀土元素化合物溶液，并进行高压蒸汽灭菌处理；所加入的单一或混合稀土元素在液体培养基中的含量为０．０００１－０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｂ．固体培养基配制：在上述液体培养基中加入６－１０ｇ／Ｌ琼脂；（２）将青蒿器官接入上述液体或固体 培养基中，在温度为２５－３０℃，光照为２０００－５０００ｌｕｘ的条件下，培养２０－３０天。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉春，赵兵，杨成砚，欧阳藩，
申请(专利权)人：中国科学院化工冶金研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]