抗肿瘤作用的融合蛋白及该蛋白的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种由人表皮生长因子与人血管生成素融合形成的融合蛋白，该融合蛋白编码基因的核苷酸序列，以该融合蛋白为活性成分的抗肿瘤药物以及该融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术的融合蛋白在较低浓度下即能在体外对多种人表皮生长因子受体阳性肿瘤细胞有明显的杀伤作用，对体内移植的实体瘤亦有显著的抑制。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗肿瘤作用的融合蛋白、以该蛋白为活性成分的药物和该蛋白的应用，特别是涉及一种具有人表皮生长因子受体特异性的融合蛋白、以该蛋白为活性成分的药物及该蛋白在制药行业中的应用。在人乳腺癌、肺癌等实体瘤细胞的表面，存在着异常大量的表皮生长因子(SEQID NO1)受体(EGFR)。依据这一特性，可以利用EGFR的配体或抗体与毒素蛋白融合，研制导向毒素式的抗肿瘤药物。国外研制的人表皮生长因子-白喉毒素，已进入临床II期，研究表明，它显示了良好的杀肿瘤细胞活性。但这类融合蛋白存在着毒素的免疫原性和毒性较大等问题。人血管生成素(Ang，SEQ ID NO2)是人体内正常存在的蛋白，具有刺激血管生成的效应，同时还有抑制细胞内蛋白质合成从而杀死细胞的作用。本专利技术的融合蛋白由人表皮生长因子与人血管生成素融合形成，该融合蛋白的编码基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。本专利技术的融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸残基序列。本专利技术的另一个目的是提供以本专利技术的融合蛋白为活性成分的抗肿瘤药物。特别是治疗乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌及上皮细胞癌的药物。本专利技术的又一目的是提供本专利技术的融合蛋白在制备抗肿瘤药物方面的用途。本专利技术的药物以本专利技术的融合蛋白为活性成分，该药物用于治疗肿瘤。在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。本专利技术的药物可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本专利技术化合物的药用量可根据患者的年龄、体重、疾病的严重程度进行调整，日剂量一般为20-100μg/kg体重。人表皮生长因子与人血管生成素均是人体中正常存在的蛋白，利用它们形成融合蛋白，可避免外源毒素产生的免疫原性，降低副作用。用血管生成素构建融合毒素，可以降低其对正常细胞的毒性和免疫原性，提高杀伤肿瘤细胞的特异性。本专利技术的融合蛋白具有很高的临床应用价值，是一种高效的导向抗肿瘤药物。下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步说明。2、融合基因在大肠杆菌中的表达所构建的融合基因转化E.coli JM109(DE3)，用作转化的大肠杆菌还可以是E.coli BL21(DE3)等其它带有DE3的大肠杆菌。经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳分析，上述融合基因在E.coli.JM109(DE3)中获得高效表达。3、融合蛋白的变性、复性以及纯化融合基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达，经过超声破碎，包涵体变性后，在复性液中复性，利用金属螯和层析获得纯度95％以上的纯品蛋白。经对该蛋白的氨基酸测序表明，所得到的蛋白确为本专利技术的融合蛋白。实施例2、融合蛋白Ang-EGF的体外细胞毒作用为了观察融合蛋白Ang-EGF对不同肿瘤细胞的生长抑制作用，专利技术人用融合蛋白Ang-EGF分别对六株肿瘤细胞做了量效关系试验。以EGF为对照，比较了融合蛋白Ang-EGF为1000nm/ml浓度时对六株肿瘤细胞体外细胞毒作用，结果如表1所示表1.各种肿瘤细胞存活百分比MDAA431 A549 MCF-7 KB HEPG2Ang-EGF 35.828.2 33.1 33.226.831.1EGF 81.8100.0102.0 81.9102 101.0其中 从表中的数据可以看出，融合蛋白Ang-EGF对人乳腺癌MDA、MCF-7，人口腔鳞状上皮癌KB，人类上皮样细胞癌A431，人肺癌A549，人肝癌HEPG2六株肿瘤细胞株有明显的杀伤作用。实施例3、融合蛋白Ang-EGF特异杀伤作用的量效关系分别比较融合蛋白Ang-EGF在0，0.1，1，10，100，1000ng/ml六个浓度时对六株不同肿瘤细胞的体外细胞毒作用，结果如附图说明图1-6所示，图中横坐标为融合蛋白Ang-EGF的浓度，纵坐标为癌细胞的最大存活率。从图中可以看出，本专利技术的融合蛋白对六株EGF受体过表达的肿瘤细胞株，随着免疫融合蛋白浓度的增大，细胞存活百分比减少，细胞毒杀伤作用增强，显示了明显的量效关系，即具有剂量依赖性。实施例4、Ang-EGF的体内抑瘤作用采用六周龄裸鼠，以口腔鳞状上皮细胞(KB)构建裸鼠肿瘤模型，细胞接种密度为105cells/只，注射于背部皮下，接种后观察肿瘤生长至肉眼可见，随机分组，其中三个试验组，Ang-EGF分别使用高(80ug/ml)、中(40ug/ml)、低(20ug/ml)二种剂量，阳性对照组使用环邻酰胺(CTX)，阴性对照组使用PBS，腹腔注射，连续注射5天，观察肿瘤生长情况，结果见表2及图7，图7中，1号为PBS组，2号为CTX组，3号为Ang-EGF组。表2 融合蛋白体内对人口腔鳞状上皮癌(KB)的抑制作用组别剂量(ug/ml) 动物数 瘤重(mg) 抑瘤率(％)PPBS 安慰剂5 916±166.4 / /CTX 400×1d 5 34.5±6.4 96.2 ＜0.01Ang-EGF 80×5d536.4±6.23 96.03＜0.0140×5d5202.8±14.81 77.8 ＜0.0120×5d5224.0±13.8 75.5 ＜0.01从表中可以看出，融合蛋白高剂量组与环邻酰胺(CTX)的抑瘤率相当，低剂量组也达到75.5％，与PBS组(对照)相比差异极显著(P＜0.01)。序列表(1)一般信息(I)申请人中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所(II)专利技术名称抗肿瘤作用的融合蛋白及该蛋白的应用(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度53个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR53(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度147个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2MVMGLGVLLLVFVLGLGLTPPTLAQDNSRYTHFLTQHYDAKPQGRDDRYC 50ESIMRRRGLTSPCKDINTFIHGNKRSIKAICENKNGNPHRENLRISKSSFQVTT 104CKLHGGSPWPPCQYRATAGFRNVVVACENGLPVHLDQSIFRRP 147(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度631碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA (xi)序列描述SEQ ID NO3TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAG 54GAT AAC TCC AGG TAC ACA CAC TTC CTG ACC CAG CAC TAT GAT GCC 99AAA CCA CAG GGC CGG GAT GAC AGA TAC TGT GAA AGC ATC ATG AGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白的编码基因，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马清钧，陈东立，许伟利，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]