蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶制备方法技术

本发明专利技术是涉及蚯蚓纤溶酶的修饰酶的制备，用活化的三聚氰氯对蚯蚓血纤蛋白溶酶进行修饰，经碱性缓冲液透析后得修饰酶。修饰酶在热稳定性和ｐＨ稳定性均强于原酶，其体内半衷期是原酶的１．４倍，且具有原料来源易、价廉、投资少等优点。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及修饰酶的制备，尤其是蚯蚓纤溶酶(EFE)的修饰酶。近年来，血栓病、心血管疾病已经成为人类健康的头号杀手。目前市售的降纤酶、蝮蛇抗栓酶、尿激酶等药物虽然已经应用于临床，但稳定性差，易失活，体内停留时间短，价格昂贵及易导致出血等临床缺陷，未及普遍推广应用。理想的溶栓药物要求可迅速溶解血栓、无毒、无出血等副作用，给药方便，价格便宜。寻找有效的治疗药物是国内外医学界重点攻关的热点之一。鉴于蚯蚓纤溶酶能溶解血栓，无毒副作用，可口服给药，生产成本低廉，人们期望能将蚯蚓纤溶酶开发成一种新型的溶栓药剂。当前，市售溶栓胶囊、地龙胶囊、“9.12”胶囊等只是蚯蚓冻干粉，在体内易受酶、抑制剂等分解破坏，也不易进入病灶细胞和组织，并且免疫原性强，体内半衰期短，这些问题显然有待进一步解决。本专利技术的目的在于针对目前蚯蚓纤溶酶药物在体内易受酶、抑制剂等分解破坏，也不易进入病灶细胞和组织，并且免疫原性强，体内半衰期短问题，采用化学修饰，延长蚯蚓纤酶的体内半衰期，降低或消除免疫原性，制备一种高效、易进入病原组织的修饰酶。在众多修饰剂中，PEG用得最多。PEG修饰法具有反应条件温和，酶活性回收率高。PEG蛋白质加合物水溶性好、无毒、无免疫原性，生物相溶性好。在PEG对EFE的修饰时，首先对PEG进行活化，用活化后的PEG对EFE进行修饰。EFE是蚯蚓血纤蛋白质溶酶的英文简写。活化方法有多种，本专利技术采用以三聚氰氯为活化剂，其活化反应为 用活化的PEG对EFE进行修饰，得到EFE修饰酶，其反应为 本专利技术是这样实现的PEG的活化三聚氰氯使用前用无水苯重结晶两次。将三聚氰氯、无水碳酸钠及PEG加入无水苯中，常温下搅拌12小时后，过滤，滤液用乙醚沉淀，沉淀物再用苯溶解，如此沉淀、溶解反复多次，直至溶解后的溶液在258nm波长下检测无光吸收。将溶液真空干燥，干燥物为活化的PEG。三聚氰氯∶无水碳酸钠∶PEG为1.1∶2∶8(重量比)，而无水苯的量为三聚氰氯、无水碳酸钠、PEG总量的7倍以上(重量体积比，g∶ml)。蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶制备于蚯蚓血纤蛋白溶酶中加入活化的PEG，蚯蚓血纤蛋白溶酶与活化的PEG比为1∶3-9(重量比)。在碱性缓冲液中，12～35℃条件下，搅拌反应30-180分钟，在0.1mol/L pH7.3的磷酸缓冲液中透析12小时后，所得的透析溶液为蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶。影响PEG修饰效果主要因素有下列几个方面(1)PEG的相对分子质量，PEG相对分子质量太大或太小，均不利于修饰效果。PEG分子质量太小，产生的空间阻碍和静电斥力太小，不能有效地阻碍抑制剂和蛋白酶对酶的进攻，不能有效地遮盖酶的活性部位，使抑制剂和被修饰酶敏感键结合，从而破坏酶活性部位。PEG分子量太大，不利于PEG与酶结合，而且太大的PEG，会阻碍修饰酶到达病灶组织和阻碍酶与底物的结合，本专利技术通过对PEG1000、2000、4000、6000R的比较，得到PEG4000修饰率和酶活性均较高。而且PEG4000的相对分子质量有利于消除或降低免疫原性，因此本专利技术选择修饰剂PEG的相对分子质量为4000最为理想。(2)PEG和酶的配比。PEG和酶的比例决定了氨基酸修饰率的大小。PEG和酶的相对比例太小，则使残留氨基较多，不利于消除或降低免疫原性。而PEG量太大，则酶的溶解度相应会降低，并造成了不必要的浪费。本专利技术通过在10mgEFE(蛋白质含量为1mg/ml，酶比活为12000U/ml)中，分别加入活化PEG40000.35、0.50、0.65、0.80、0.95g，在0.1mol/L pH9.2的四硼酸钠缓冲液中反应1小时，产物对pH 7.3的0.01mol/L磷酸缓冲液透析，分别测定酶活和残留氨基量。结果表明，随PEG量的增加，相对酶活力有降低趋势。当PEG用量大于0.65g时，修饰氨基几乎没有变化。因此确定的最低PEG修饰用量为每10mg酶蛋白，PEG4000用量为0.65g。(3)修饰的pH值。在以三聚氰氯活化的PEG与酶蛋白反应的产物中，除了修饰酶外，还有HCl。根据化学平衡，要使反应向右进行，最好是尽快减少HCl的积累量。因此，此修饰反应在碱性(pH9.2)条件下进行，以便中和HCl。当然，碱性太强，会使酶蛋白变性而失去活性。综合氨基修饰率和酶活力，本专利技术确定的最佳反应pH值为9.2。(4)修饰时间。一般来说，反应时间越长，反应越彻底。但实践证明，反应超过一定时间后，氨基修饰率并无变化。而且反应时间太长会使酶蛋白变性，也浪费时间。所以本专利技术得优化的修饰时间为1h最佳。本专利技术所获得的修饰酶(与原酶比较)对其部分酶学性质和体内半衰期进行测定。结果是原酶和修饰酶的酶学性质修饰酶的Kmapp为原酶1/4(以BAEE为底物)，为0.3×10-3mol/L；原酶与修饰酶的pH稳定性分别为pH5.8-10.0、pH5.8-10.6；原酶与修饰酶的热稳定性分别为20-55℃、20-55℃；原酶与修饰酶的反应最适温度均为55℃；原酶与修饰酶的反应最适pH分别为pH7.8和pH10.0；修饰酶对蛋白酶的抵抗能力较原酶有所提高；贮藏稳定性修饰酶和原酶的溶液于常温下5个月活力基本不变；修饰酶的活力是原酶的85％，氨基修饰率为70％；酶活性抑制剂PMSF(苯甲磺酰氟)、Hg2+；两种酶在200～800nm波长下吸收光谱未发生变化，说明PEG对EFE的修饰可能未引起EFE的结构的变化。本专利技术的优点(1)以蚯蚓为原料，原料来源容易，价廉，并且会带动蚯蚓的综合利用；(2)本专利技术的工艺生产设备投资少；(3)修饰酶热稳定性和pH稳定性均强于原酶，其体内半衰期是原酶的1.4倍，且很有可能无免疫原性或免疫原性很低；(4)修饰过程较为简单；(5)修饰酶活力高达8000U/ml·酶液(底物为BAEE)。实例取10mg分离纯化的蚯蚓纤溶酶蛋白，蛋白质含量为1.5mg/ml，酶比活为8200U/ml，在12～30℃条件下，加入0.65g活化的分子量为4000的PEG，在pH9.2的四硼酸钠缓冲液中搅拌反应1小时，产物对0.1mol/L、pH7.3的磷酸缓冲液透析12小时后，透析后的溶液即为修饰酶溶液。氨基修饰率为70％，活力回收达85％。权利要求1.蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶(EFE)制备方法，其特征在于在蛋白质含量为1.5mg/L，酶比活为8200U/ml的蚯蚓血纤蛋白溶酶中加入活化的PEG10000-60000、0.35-0.95g，在pH7.0-9.5碱性缓冲液中搅拌反应30-180分钟，用磷酸缓冲液透析12小时后，所得的透析溶液为蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶。2.根据权利要求1所说的修饰酶(EFE)制备方法，其特征在于其加入PEG的分子量为4000较理想，加入量为0.65g较适宜，较理想的碱性缓冲液为pH9.2磷酸缓冲液。较理想的搅拌反应时间为60分钟。3.根据权利要求1所说的蚯蚓血纤蛋白溶酶(EFE)修饰酶的制备方法，其特征在于所说PEG的活化，将PEG与三聚氰氯和无水碳酸钠混合后，加入无水苯中，常温下搅拌12h，过滤，用乙醚沉淀，沉淀物用无水苯溶解，再用乙醚沉淀，如此沉淀、溶解反复多次，直至溶解的溶液在258nm波长下检测无光吸收。将此溶液真空干燥，干燥物为活化本文档来自技高网...

【技术保护点】
蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶（ＥＦＥ）制备方法，其特征在于：在蛋白质含量为１．５ｍｇ／Ｌ，酶比活为８２００Ｕ／ｍｌ的蚯蚓血纤蛋白溶酶中加入活化的ＰＥＧ１００００－６００００、０．３５－０．９５ｇ，在ｐＨ７．０－９．５碱性缓冲液中搅拌反应３０－１８０分钟，用磷酸缓冲液透析１２小时后，所得的透析溶液为蚯蚓血纤蛋白溶酶的修饰酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐凤彩，高向阳，伍晓斌，詹福建，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]