给基质提供具有现成的均匀分布的细胞外基质的方法技术

给基质提供现成的均匀分布的胞外基质的方法。该方法包括将胞外基质组分施涂于基质区域；保温胞外基质组分使之聚合；冷冻位于基质区域表面的、聚合的胞外基质；冻干位于基质区域的冷冻的胞外基质；将冻干的胞外基质温度回升到室温。还涉及细胞培育装置，它具有通过上述方法形成的干燥的均匀分配胞外基质。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利技术的领域本专利技术涉及提供一种独特的细胞培养基的方法。更具体地说，本专利技术涉及从细胞培养装置中提取液体的方法，所述地装置包括粘附在基质上的均匀分布的胞外基质。2.相关的
技术介绍
存在于细胞间的纤维状和球形蛋白质的网状系统称之为胞外基质(ECM)。ECM是细胞环境的一种重要组成部分。细胞分泌的各种ECM成分形成基质间质和基质膜，在体内细胞锚定在该构架上。这些结构提供了组织特异性组织学的机体形成和发展所需要的空间定位和稳定性。然而，ECM并不仅仅是无活性的支架，而是一种在调节细胞的生长和分化中的必需物。ECM提供了一种环境，在正常的病理重新成型过程中(如胚胎发育，组织修复，炎症，肿瘤侵入和转移)调节细胞功能时扮演着重要角色。例如，ECM对生长因子的诱导，结合，储存和呈递功能是公知的。认识到ECM是在细胞微环境的重要组成成分这一事实后，越来越多的研究者正将细胞外基质掺入到它们的细胞培养系统。ECM的体外应用，给细胞提供尽可能接近于它们在体内的生理环境状态。ECM为细胞提供机械支撑，并通过提供生物化学信息(所述信息通过细胞表面受体而影响细胞)，影响细胞的行为。基质膜是一种特殊类型的胞外基质，主要由层粘连蛋白和IV型胶原构成。从Englelbreth-Holm-Swarm老鼠瘤提取的著名的基质膜基质，以MATRIGEL的商品名称出售。这种老鼠瘤富含基质膜蛋白质。这种基质的主要成分是层粘连蛋白、IV胶原、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，也含有生长因子、基质金属蛋白酶(MMPs)，和其他的蛋白酶(血浆酶原活化剂)，以及几种未界定的化合物，但是并不含有可检测水平的金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)。在室温下，MATRIGEL基质凝胶化并形成重构的基质膜，在结构、成分、物理性能和在体内保持功能特性的能力方面与活体基质膜相似。已经使用MATRIGEL基质开发了一些方法，从而在体外研究肿瘤细胞侵入基质膜基质的情况。典型的，这些方法涉及将MATRIGEL基质包被在细胞培养插件(inserts)的微孔膜上。制备含有ECM的细胞培养体系的常规技术包括，首先加热冰冷的、中性可溶胶原的溶液，以诱导天然的原纤维发生聚合和沉淀。在升高到4℃以上的温度下保温MATRIGEL基质，可聚合这种基质。然而，细胞培养中使用的无定型、化学交联和碱性改性的胶原质膜常常被干燥，以改进储存寿命并且不必每次使用前制备这种细胞培养基，因而制备含有天然的纤维胶原质的细胞培养基并仅仅使用天然纤维的固定的、粘着的凝胶的形式。这些凝胶通常按照上述方法生产，即通过加热冰冷的、中性的可溶胶原溶液以诱导天然原纤维发生聚合和沉淀。可是，它们不能干燥储存，因为早先使天然纤维胶原质凝胶收缩和干燥的作法导致了天然结构的丧失，次最佳的纤维形成和差劲的渗透性能。因此，必须在使用之前制备天然纤维胶原质的细胞培养基。这增加了采用天然纤维胶原质的细胞培养进行研究的劳力和不方便性。于是，存在一种对于含有天然纤维胶原(如在MATRIGEL基质中发现的天然纤维胶原质)的细胞培养基的需求，该培养基能够在使用之前用制备物进行制备。制备含有天然纤维胶原的细胞培养装置的常规方法，在使用之前和凝胶聚合后希望清除残存在基质中的液体。从ECM清除液体的常规方法包括空气干燥和在提高的温度下干燥。通常提高温度的干燥条件包括在提高温度的情况下采用干燥气流的快速干燥，该方法可促进大的盐结晶和更明显的MATRIGEL基质模式。迅速的MATRIGEL基质干燥导致侵入细胞的分布不好。常规液体清除技术也包括将多孔表面的下面放在吸附材料上一段时间(3分钟到过夜)和/或对多孔表面使用温和的真空。在缓慢的降低温度和没有空气流的情况下缓慢清除液体，导致最均匀的包被层和侵入的细胞最均匀的分布。例如，Swiderek等人的美国专利5,731,417揭示了制造用于细胞培养的天然胶原干膜的方法，其中包括空气干燥基质。常规干燥方法降低了细胞培养装置的功能。例如，常规包被和干燥方法通常导致不均匀或中断的涂层，从而产生不均匀细胞的侵入，例如形成诸如侵入细胞显著的中心点或环的等各种模式。因此，在显微镜下精确计算侵入细胞是十分困难的。另外，区别侵入和非侵入细胞的能力明显降低。侵入细胞包括HT-1080细胞，而非侵入细胞包括NIH3T3细胞。因此，分布的纤维胶原基质例如MATRIGEL基质宜为均匀和密实的。专利技术的概述本专利技术涉及一种细胞培养装置和方法，它们包括干燥的胞外基质和并已被开发用于细胞的体外生长。特别是本专利技术提出一种方法，该方法提供具有现成的均匀分布的胞外基质的基质，该方法包括a)将胞外基质组分施涂在基质区域；b)保温胞外基质组分，使之聚合；c)冻结位于基质区域的聚合的胞外基质；d)冻干位于基质区域的、冷冻的胞外基质；e)让冻干的胞外基质升温到室温。本专利技术的另一个方面是提供一种细胞培养装置，它包括用于细胞生长的表面，所说的表面附着有干燥的均匀分布的胞外基质，所说的基质按照下述步骤形成a)将胞外基质组分施涂在基质区域；b)保温这种胞外基质组分使之聚合；c)冻结位于基质区域的聚合的胞外基质；d)冻干冷冻的位于基质区域的胞外基质；e)让冻干的胞外基质升温到室温。本专利技术也提供一种细胞培养装置，它包括适合细胞生长的表面；和位于这个表面上的胞外基质包被层，基质包被层包括生物活性蛋白溶液的聚合产物，而基质内残存的液体通过冻干法基本被清除。本专利技术试图提供一种方法，解决以前工艺的不足之处，这种方法提供一种含有胞外基质的细胞培养装置，所述胞外基质的分布均匀分布，能在更广的ECM浓度范围内有效，在整个细胞培养表面获得高度均匀的肿瘤细胞迁移，便于细胞计数，可区分侵入肿瘤细胞和推测的非侵入对照细胞。另外，本专利技术也包括细胞培养装置，该装置包含在使用之前制备好的胞外基质。专利技术的详细描述本专利技术提供从基质的一个边缘到另一边缘的高度均匀的胞外基质包被层，并且与常规液体干燥工艺制备的基质相比，能在更广的胞外基质浓度范围内有效。均匀的包被层使得在完整的胞外基质表面上提供了高度均匀的肿瘤细胞的迁移，与之相反，常规工艺中细胞的迁移以非常不均匀方式发生在膜的中心。细胞的均匀迁移便于用手工方法或图象分析方法进行细胞计数。冻干包被层也有更强的区分侵入肿瘤细胞和设想的非侵入对照细胞的能力。在任何本领域已知的细胞培养方案和方法中，常规的胶原细胞培养基质可以用具有干的天然纤维胶原的细胞培养装置加以替换。在多孔表面上的天然纤维胶原细胞培养基质，被置于组织培养板的孔中，并且多孔表面与合适的培养基相接触。这允许培养基流过多孔表面并与细胞培养基质接触。培养基和其他存在于其中的物质可扩散通过细胞培养基质，与在表面接种的细胞接触。为了易于操作，细胞培养基质可以在细胞培养插件的微孔膜上制备。一旦将冰冷的胞外基质施涂在多孔表面，就让冰冷的、中性胶原溶液的温度升高到大约15℃到大约40℃，从而引发形成天然胶原纤维和纤维。对于本专利技术的保温步骤，温度宜升高，优选大约37℃，并且在潮湿箱中含有5％的二氧化碳。当胶原溶液的温度增加时，天然的原纤维在多孔表面上开始聚合和凝胶化，从而包被在上面。凝胶包括大的、有组织的、并且具有天然胶原的条纹特性的胶原纤维和从胶原溶液中俘获的液体(纤维间液体)。保温步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种给基质提供现成的均匀分布的胞外基质的方法，其特征在于，包括步骤：ａ）将胞外基质组分施涂在基质区域；ｂ）保温所述的胞外基质组分，使之聚合；ｃ）冷冻位于所述基质区域冷冻的该聚合的胞外基质；ｄ）冻干位于所述基质区域的、冷冻的胞 外基质；ｅ）将冻干的胞外基质升温到室温。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A迈尔斯，SR伊尔斯利，FJ马努扎，
申请(专利权)人：贝克顿迪肯森公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]