麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521及诱导方法技术

本发明专利技术涉及通过将农杆菌导入麻黄属植物，诱导麻黄属植物产生麻黄冠瘿瘤细胞（Ｅｐｈｅｄｒａ）ＺＨＡ－２ ＣＧＭＣＣ ＮＯ．０５２１以及诱导方法。本发明专利技术诱导的麻黄冠瘿瘤细胞（Ｅｐｈｅｄｒａ）ＺＨＡ－２，已经于２０００年１２月１１日保藏在中国微生物保藏中心。该麻黄冠瘿瘤细胞具有在含有少量激素的蔗糖琼脂培养基上，于２３～３２℃左右培养本菌株１０～１５天，麻黄冠瘿瘤细胞形态呈现不规则类球形团块状，表观为浅黄色至深绿色，直径在０．５～１５毫米。本发明专利技术的诱导方法是以麻黄属植物，利用农杆菌Ｔｉ质粒作为载体，将外源基因导入麻黄属植物在培养液中诱导麻黄冠瘿瘤细胞（Ｅｐｈｅｄｒａ）ＺＨＡ－２ ＣＧＭＣＣ ＮＯ．０５２１；所诱导的麻黄冠瘿瘤细胞可以在１．０～５．０％糖的培养基中进行继代培养，在２３～３２℃下培养５－６０天，获得的麻黄冠瘿瘤细胞的增殖量为接种时的２～８倍，麻黄碱的含量为０．１～２５ｗｔ％。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用生物技术从麻黄属植物诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521。更具体地，本专利技术涉及通过将农杆菌导入麻黄属植物，诱导麻黄属植物产生麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521及其诱导方法。
技术介绍
麻黄植物中主要含有麻黄碱、伪麻黄碱、L-N甲基麻黄碱、d-N甲基伪麻黄碱、L-去甲基麻黄碱、d-去甲基伪麻黄碱等。麻黄草是一种常用中草药，具有发汗，平喘，祛风等作用。麻黄碱与肾上腺素一样能够兴奋交感神经，但麻黄碱可以口服，且作用时间长，此点为肾上腺素所不能。麻黄碱能使支气管扩张，鼻黏膜收缩，并使血压升高，临床用于特效治疗咳嗽、气喘、枯草热和百日咳等，并能减低月经痛病的疼痛，亦能作散瞳药物。众所周知，在生物反应器内实现天然植物细胞培养是近年来生物技术研究的一个重要方向。然而迄今为止，反应器培养所产生的目标活性物质(如许多天然药用活性组分)含量还不高，为提高产量，植物学家做了大量的育种以及基因调控地研究，生化工程研究者则正在从培养工艺等方面寻找突破。印度、美国和英国的研究人员通过麻黄植物诱导愈伤组织，利用麻黄细胞培养生产麻黄碱。研究了光照条件、改变培养基的各种成分和比例等外界条件对麻黄细胞生产麻黄碱的影响。麻黄细胞培养物中麻黄碱的含量为0.17～0.6％。愈伤组织培养物是松散的，细胞组织颗粒的直径不等，大约在2～200μm，在利用细胞培养物生产次生代谢产物的过程中，特别在生物反应器内培养植物细胞生产代谢产物的过程中，培养液和细胞培养物不易分离。此外，愈伤组织培养物的生长和代谢产物的合成往往矛盾。而一般冠瘿瘤细胞呈团块状，冠瘿瘤细胞组织颗粒直径较大。冠瘿瘤细胞内部有细胞或组织的分化，因此其产生次生代谢产物的能力要高于分散的细胞，同时这种组织又有较快的生长能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过麻黄植物诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2CGMCC NO.0521；利用麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521得到的培养物可以大幅提高生物量和培养物中麻黄碱的含量，目的之二是克服已有在生物反应器内培养植物细胞生产代谢产物的过程中，培养液和细胞培养物不易分离，愈伤组织培养物的生长和代谢产物的合成往往矛盾的缺点，从而提供一种麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521及其诱导的方法。本专利技术提供的麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2已于2000年12月11日保藏在中国微生物保藏中心(其简称为CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.0521。麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521的微生物特性(1)麻黄冠瘿瘤细胞的生态特征在含有少量激素的蔗糖琼脂培养基上，于23～32℃左右培养本菌株10～15天，麻黄冠瘿瘤细胞形态呈现不规则类球形团块状，表观为浅黄色至深绿色，直径在0.5～15毫米。(2)生理生化特征麻黄冠瘿瘤细胞的生长可以利用多种糖原，合适的培养温度为23～32℃，高于40℃细胞组织生长缓慢直至死亡；合适的生长pH值为5.0～6.0；麻黄冠瘿瘤细胞组织内部有一定的组织分化结构。在光照和无光照的条件下均可以生产麻黄碱。过氧化物同工酶是麻黄冠瘿瘤细胞生长的活性标志，苯丙氨酸转氨酶是合成麻黄碱的关键酶，其与麻黄碱的合成成正比关系。本专利技术提供了利用外源基因导入麻黄属植物细胞，产生麻黄冠瘿瘤细胞的方法。本专利技术中所用的麻黄属植物有木贼麻黄Ephedra equisetina Bunge，草麻黄Ephedra sinica Stapf，中麻黄Ephedra intermedia Schrenk，膜果麻黄Ephedraprzewalskii Stapf；木麻黄Casuarina Adans，以及单子麻黄，蓝枝麻黄，双穗麻黄，细子麻黄等。本专利技术利用农杆菌Ti质粒作为载体，将外源基因导入麻黄属植物诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521的步骤按如下顺序进行(1)将麻黄属植株用洗涤剂溶液洗净，蒸馏水冲洗三遍；再用消毒剂灭菌10～30分钟，用已灭菌的蒸馏水洗净，得到灭菌的麻黄属植株；所述的消毒剂如1-5％次氯酸钠或10～15％双氧水(按体积比计)，或0.1～1.0％升汞水溶液(按重量/体积比计)；(2)将上述步骤(1)已灭菌的麻黄属植株切成0.3～1.0厘米长短，放入装有已经稀释5～20倍(OD600为0.6～0.8)的农杆菌的培养液的摇瓶中，将摇瓶放在转速为150rpm摇床上共同培养5～60分钟，培养温度为23～32℃，得到被农杆菌感染的麻黄属植株；(3)将上述步骤(2)的被农杆菌感染的麻黄属植株放在含有0.5～5.0wt％抗生素的培养基中培养5～20天，培养温度为23～32℃，麻黄属植株上逐渐生长出麻黄冠瘿瘤细胞；所述的抗生素包括羟苄青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素等；(4)将上述步骤(3)所获得的麻黄冠瘿瘤细胞从其生长的植株上切下，转移至新配制的步骤(3)的培养基中培养10～20天，培养温度为23～32℃，得到继代培养的麻黄冠瘿瘤细胞；为了提高麻黄碱的含量，还可以包括以下的继续培养方法将上述步骤(4)所获得的麻黄冠瘿瘤细胞放在步骤(3)的培养基中连续培养10～60天，培养温度为23～32℃，得到含有麻黄碱0.1～25wt％的麻黄冠瘿瘤细胞培养物。其中所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基(步骤(3)-(5)所用的培养基)组成如下为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.1～100mmol/L苯丙氨酸。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.01～150mmol/L甲酸钠。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.1～50mmol/L丝氨酸。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.05～150mmol/L甲硫氨酸。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加0.01～200mmol/L酪氨酸。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.025～250mmol/L色氨酸。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入1.0～50％体积比真菌发酵液。为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种麻黄冠瘿瘤细胞（Ｅｐｈｅｄｒａ）ＺＨＡ－２ ＣＧＭＣＣ ＮＯ ０５２１，该麻黄冠瘿瘤细胞（Ｅｐｈｅｄｒａ）ＺＨＡ－２ ＣＧＭＣＣ ＮＯ ０５２１具有以下微生物特性：（１）麻黄冠瘿瘤细胞的生态特征：在含有少量激素的蔗糖琼脂培养基上 ，于２３～３２℃左右培养本菌株１０～１５天，麻黄冠瘿瘤细胞形态呈现不规则类球形团块状，表观为浅黄色至深绿色，直径在０．５～１５毫米；（２）生理生化特征：麻黄冠瘿瘤细胞的生长可以利用多种糖原，培养温度为２３～３２℃，高于４０℃细胞组织 生长缓慢直至死亡；合适的生长ｐＨ为５．０～６．０；麻黄冠瘿瘤细胞组织内部有一定的组织分化结构；在光照和无光照的条件下均可以生产麻黄碱；过氧化物同工酶是麻黄冠瘿瘤细胞生长的活性标志，苯丙氨酸转氨酶是合成麻黄碱的关键酶，其与麻黄碱的合成成正比关系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：查丽杭，张国政，秦川，朱维型，苏志国，欧阳藩，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，新疆托峰药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]