在人正常神经胶质细胞与神经胶质细胞瘤中具有表达差异的基因NECL2制造技术

本发明专利技术涉及一个在人神经系统中高度表达的基因（ＮＥＣＬ２），包括互补脱氧核苷酸（ｃＤＮＡ）序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因编码的蛋白质定位于细胞的细胞质膜上，在正常神经细胞元中高度表达，在正常神经胶质细胞与神经胶质细胞瘤中的表达具有明显差异。在维持神经系统的生理功能及某些神经系统疾病的发生过程中可能具有重要的作用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为一个在人神经胶质细胞瘤与正常神经系统中具有明显表达差异的基因/蛋白，人的类nectin蛋白2的基因及其编码蛋白，(nectin like gene/protein，NECL2/NECL2)，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白的开发与应用领域。免疫球蛋白超家族是神经系统发育及功能维持的决定性因素之一。这一家族的成员都一个或多个Ig结构域，为GPI锚定蛋白，或为单跨膜蛋白。这些免疫球蛋白超家族成员在神经形态发生的多个方面如在神经元前体的迁移，神经突起的成簇以及接触依赖的轴突导向等都有重要作用。免疫球蛋白超家族成员不仅结构多样，而且在与其他免疫球蛋白成员或其他蛋白家族成员相互作用时也表现出高度的复杂性。人的脊髓灰质炎病毒受体(Pvr)是免疫球蛋白超家族的一个成员，有一个NH2-信号序列，三个胞外Ig样结构域，一个穿膜区和一个胞质尾巴。Pvr的序列类似物nectin-1，nectin-2 and nectin-3，它们与Pvr有同样的结构域组成形式。Nectin-1 and Nectin-2蛋白的胞内区与1-afadin(一个肌动蛋白结合蛋白)相互作用，并通过1-afadin与细胞骨架相连。而我们实验室克隆到的NECL2，是免疫球蛋白超家族的一个新成员，与脊髓灰质炎病毒和nectin类似，都有三个Ig样结构域，一个穿膜区和一个胞质尾巴。其中胞质部分与红细胞膜蛋白Glycophorin C胞内区有55％的一致性。而且NECL2与本室以前克隆到的BL1同源性为56％，胞内区同源性达85％，属于一个新的免疫球蛋白家族。Northern杂交证实NECL2在多种组织中表达，在成人小脑、大脑皮层、丘脑、下丘脑、垂体、睾丸、甲状腺及胎盘高表达，在胎儿脑、肝脏与肺中表达较高。原杂和组化实验表明NECL2在正常人的胶质细胞不表达，而在胶质瘤病人的胶质细胞中有明显表达。利用IAsys验证了NECL2和蛋白4.1家族的体外相互作用。专利技术目的克隆在在人神经胶质细胞瘤与正常神经系统中具有明显表达差异的基因NECL2，表达其编码蛋白，阐明NECL2蛋白在神经系统中与细胞骨架蛋白的相互关系，以及从分子水平上阐明其表达差异在神经胶质细胞瘤中机理，从而为干预肿瘤细胞的增殖提供可能的抑癌基因和新药筛选的靶分子。内容与要求本专利技术的内容是应用基因组信息学原理、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、分子克隆、DNA序列测定技术克隆神经系统高度表达基因NECL2，并用Northern杂交及原位杂交技术进行了组织细胞与病理表达分析。该基因/蛋白达到的技术指标为1.人NECL2全长cDNA为3512bp，其阅读框架为1326bp，编码442个氨基酸。2.该基因所编码的蛋白N端与nectin家族中的其他成员有较高的同源性，并且有三个Ig结构域。C端与红细胞的Glophorin C有55％的一致性，与蛋白4.1家族的相互作用已得到Iasys验证。3.将NECL2 cDNA全长连至黄色荧光蛋白载体中，转染BT325细胞，很明显NECL2定位在细胞膜上。4.人NECL2基因在成人与胎儿神经系统中高度表达。NECL2广泛表达，除骨骼肌为3kb左右转录本外，在其余组织皆有1.8kb及4.5kb两个转录本，在脑中以4.5kb转录本为主。在小鼠中存在NECL2的同源基因，其表达谱要广泛的多。原位杂交显示其在大脑皮层，海马，齿状回，脑干的多种神经核团及脊髓前后角神经元细胞中高度表达；在正常胶质细胞中无明显信号。神经胶质细胞瘤的原位杂交及免疫组化显示胶质细胞瘤中有明显信号。5.该基因及其编码蛋白与神经系统正常生理功能的维持及肿瘤发生等生命现象密切相关，可用于脑发育相关疾病，肿瘤发生的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。载有心、脑、肾、肺、肝、胎盘、骨骼肌、胰腺Multiple Tissue Northern(MTNTM)Blot购白Clontech公司。将阳性克隆用HindIII切下的436个bp作为探针。探针标记使用Promega标记试剂盒，室温标记α-32P-dCTP1小时。杂交液采用Clontech公司的ExtressHybTMHybridization Solution。按照Clontech公司杂交使用手册杂交过夜。杂交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用双面增感屏，-70℃曝光。小鼠NECL2表达广泛。多组织Northern杂交显示小鼠NECL2在心、脑、肺、肝、骨骼肌与睾丸皆有表达，睾丸表达量较高，而脾与肾表达量低。除骨骼肌为3kb左右转录本外，在其余组织皆有1.8kb及4.5kb两个转录本，在脑中以4.5kb转录本为主，这与Hirokigomyo等对人NECL2的Northern杂交结果相符。载有脑组织分区及其他非脑组织的RNA Master BlotTM购自Clontech公司。阳性克隆用NocI切下的近500bp作为杂交探针，用上述方法标记探针。杂交液采用Clontech公司的ExtressHybTM Hybridization Solution。65℃预杂交30min，后加入标记的变性探针及用于封闭的30ugC0t-1 DNA、150ug ssDNA及50ul 20×SSC，65℃杂交6小时。杂交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用双面增感屏，-70℃曝光。3.人胶质瘤及正常白质切片原位杂交选用人NECL23’非编码区的片段作为探针区域，PCR扩增后连接到T-easy载体中，分别用Sal1/T7、Ncol/Sp6酶切，作为原位杂交正反义探针模板。使用Promega的DIG标记RNA探针试剂盒，作体外转录，并引入DIG-C，从而合成地高辛标记的RNA杂交探针。同时用多聚甲醛灌流固定小鼠，取人脑及脊髓组织进行切片，以制备好的正反义探针按照原位杂交手册行漂染杂交。4.利用融合黄色荧光蛋白进行细胞定位将此基因从核酸1-1335位(包括翻译起始位点及前面的Kozak序列)融合到黄色荧光蛋白的N端，转染BT325细胞，进行细胞定位。设计上下游引物并分别引入KpnI、XhoI的酶切位点，上游ccgctcgagaccatggcgagtgtagtg，下游ggtaccgtgatgaagtactctttctt，将PCR获得的片段连于pEYFP-Nl载体中，构建能够表达融合蛋白的重组质粒。利用脂质体将重组质粒转染BT325细胞，48小时后获得高效的瞬时表达。在荧光显微镜下观察定位结果。5.蛋白的原核表达、纯化及动物免疫与多克隆抗体的获得设计引物，上游gaagatctgggcgctattttgccagacat，下游cgcgtcgacagcaaatcccaagccttccc，以扩增NECL2蛋白C端。按正确读码框架插入pGEX-4T-1的原核表达载体中。将上述重组克隆转化感受态宿主细胞BL21，1mMIPTG诱导表达，SDS-PAGE检测目的蛋白。大量表达的融合蛋白GST-NECL2用GST亲和系统初步纯化，得到纯化蛋白。以纯化后的目的蛋白免疫饲养的新西兰纯种大白兔(方法见分子克隆)。经过一次基础免疫和两次加强免疫后，每次免疫后一周收集的抗血清并经ELISA检测抗体滴度。待达到本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一神经系统高度表达的基因ＮＥＣＬ２，其特征在于：互补脱氧核苷酸（ｃＤＮＡ）全长３５１２ｂｐ，含一个１３２６ｂｐ的完整开放阅读框，编码４４２个氨基酸，分子量为４８．５ｋＤａ的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：袁建刚，强伯勤，彭小忠，胡晓燕，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]