在转基因植物中激活和除去转基因的诱导型位点特异性重组制造技术

本发明专利技术公开了与位点特异性重组系统结合的诱导型启动子系统，其允许（ｉ）在特定的时间特异地激活转基因或（ｉｉ）从转基因植物中切除和除去转基因（例如，抗生素抗性标记）。这些“自杀”基因表达盒，包括重组系统本身，一旦它们的功能已经发挥，可以从植物基因组中收回。该系统基于时空诱导ＣＲＥ重组酶的表达，该重组酶随后结合位于所述的转基因侧翼的直接重复的ｌｏｘ位点，导致精确切除基因表达盒。本发明专利技术还公开了激活倒置的所以是沉默的转基因的方法，其是将两个ｌｏｘ位点以相反方向放置于转基因的侧翼。这导致了在存在ＣＲＥ重组酶时间插ＤＮＡ片段倒置。这样的激活可以通过将ＣＲＥ重组酶置于诱导型启动子的控制下来按预定时间进行。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
转基因技术已经变成在多细胞生物体中解决重要生物问题的有力工具，尤其是在植物领域。许多传统遗传学不可能完成的方法现在通过转基因技术已经实现，包括在植物中导入同源或异源基因，所述基因功能得以修饰并且表达方式得以改变。这样的技术的成功经常是依赖于利用鉴定转基因植物的标记和控制转基因表达的启动子。在植物转化中广泛利用了可选择标记。在历史上，这样的标记经常是编码抗生素或除草剂抗性的显性基因(Yoder和Goldsbrough，1994)。虽然这样的标记用途很广，它们确实有一些缺点。用于选择转化细胞的抗生素和除草剂通常对增殖和分化具有负作用，并且可能在转化过程中延迟不定枝的分化(Ebinuma等人，1997)。同时，一些植物种类对这些选择试剂是不敏感的或有耐受性的，因此分离转化的和未转化的细胞或组织是困难的(Ebinuma等人，1997)。另外，这些基因是组成性地表达的，在生长于实验室外的植物中插入这样的组成性表达的基因时，有环境和健康方面的问题(Bryant andLeather，1992；Gressel，1992；Flavell et al.，1992)。只在期望的时间内沉默或除去这样的标记基因或其它基因或表达它们的系统是非常有用的。将这样的基因放置于可诱导的或特异于组织的启动子的控制下已经完成。例如，已经将在热休克(Medford etal.，1989)，光(Redig et al.，1996)，铜(McKenzie et al.，1998)，四环素(Redig et al.，1996；Faiss et al.，1997；Gatz et al.，1992)或地塞米松(Kunkel等人1999)诱导型启动子的控制下的ipt基因的转基因植物用于研究细胞分裂素的生物效应。其它可诱导系统包括热诱导表达系统(Lyznik等人，1995)，乙醇可诱导系统(Caddick等人，1998)，蜕皮激素系统(Martinez等人，1999)，和TGV地塞米松/四环素系统(Bohner等人，1999)。虽然发生的频率非常低，并且出现在长期的培养后，但是利用可转座元件Ac切除标记基因已经进行(Ebinuma等人，1997)。切除基因的另一个方法将利用Cre/lox系统。噬菌体P1 Cre/lox位点特异性重组系统(Dale和Ow，1990；Odell等人，1994)包括两个成分(I)重组酶(CRE)和(ii)重组酶作用的重组位点(lox)。CRE基因编码能够在没有任何其它因子的情况下催化两个lox位点之间的重组的38Kda的重组酶。Lox位点包括对称的8bp的间隔子分开的两个倒置的13bp重复，其中每个倒置的重复是CRE的结合位点。8bp的间隔子的对称特性给出了lox位点的方向性，确定了重组事件的类型。两个倒置的lox位点的存在导致了干扰DNA序列的倒置，而两个直接重复的lox位点的存在导致能够切除干扰DNA序列。除了叙述的噬菌体P1 Cre/lox系统，有几个位点特异性重组系统已经显示能在植物中工作，这些包括(i)来自啤酒酵母的FLP-FRT系统(O’Gorman等人，1991)，(ii)来自噬菌体Mu的GIN/gix系统(Maeser and Kahmann，1991)和(iii)来自Zygosaccharomyces rouxii的R/RS系统(Onouchi等人，1991)。来自啤酒酵母的FLP-FRT重组系统是基于FLP重组酶在FLP重组靶位点(FRT)上的位点特异性重组。FRT包括两个倒置的13碱基对重复和FLP重组酶作用的8碱基对间隔子。通过插入两个侧接靶基因的方向性重复FRT位点，在FLP重组酶的作用下，通过位点特异回收切除干扰DNA片段是可能的。FLP重组酶介导的切除也已经显示是可逆的，提供了在哺乳动物染色体的特异位点中导入DNA的方法(O’Gorman等人，1991)。噬菌体Mu编码的Gin倒置酶催化了噬菌体中的G区段的位点特异倒置。重组位点(gix)在长度上是34个碱基对，两个位点包括两个交叉区隔开的两个逆向的半位点。GIN通过与两个半位点结合作用于gix位点，介导了DNA交换，和由此的DNA倒置。来自Zygosaccharomyces rouxii的pSR1的R基因编码介导两个重组位点(RS)之间的位点特异性重组的重组酶。在pSR1上的RS位点含有一对959个碱基对的倒置重复序列，它们含有重组位点(58个碱基对)。根据RS位点的方向性，没有任何其它因子，RS重组酶仍然可以催化大DNA片段(约200,000个碱基对)的切除(方向重复)或倒置(相反方向)。本文利用的公开物和其它材料说明了本专利技术的背景或提供关于本方法的其它细节，都引入作为参考，为了方便，归结在附加的参考文献列表中。该系统基于在时间和空间上诱导CRE重组酶的表达的能力，然后重组酶与正讨论的转基因侧接的直接重复lox位点结合，导致准确地切除基因表达盒。为了测试这一系统，利用萤火虫萤光素酶(LUC)报道基因作为重组标记设计允许在植物中检测准确切除事件的构建体。图2A-B表示了来自两个独立的转基因拟南芥品系的DEX处理的和非DEX处理的叶子，表示了可诱导的位点特异性重组和“填充片段”的收回。用萤光素酶活性表示了阳性重组部分。图3是表示干扰转基因的可诱导的位点特异倒置的原理。G1090驱动三杂合体转录因子GVG的启动子；3A-terrbcs 3A polyA附加序列；6xUASGVG的6X结合位点；CaMV-terCaMV polyA附加序列；NOS-ter胭脂碱合酶poly附加序列；E9-terrbcs E9 polyA附加序列。图4是能够组成性地表达标记转基因，接着可诱导地切除DNA盒的二元载体的图解说明。X表达盒编码需要的遗传特性的转基因；G1090驱动三杂合体转录因子GVG的启动子；3ATrbcs 3A polyA附加序列；6xUASGVG的6X结合位点；NOST胭脂碱合酶polyA附加序列；E9Trbcs E9 polyA附加序列；NOS胭脂碱合酶启动子。图5是能够可诱导地表达标记转基因，接着可诱导地切除DNA表达盒的二元载体的图解说明。X表达盒编码需要的遗传特性的转基因；G1090驱动三杂合体转录因子GVG的启动子；3ATrbcs3A polyA附加序列；6xUASGVG的6X结合位点(高亲和力)；1XUASGVG的1X结合位点(低亲和力)；NOST胭脂碱合酶polyA附加序列；E9Trbcs E9 polyA附加序列；NOS胭脂碱合酶启动子。专利技术详细说明本专利技术证明了将GVG可诱导系统与噬菌体P1 Cre/lox位点特异性重组系统结合使用可以从转基因拟南芥植物位点特异性地切除DNA片段(美国专利申请系列编号09/014,592，引入本文作为参考，Aoyama和Chua，1997)。产生的构建体pGVG-Cre/lox-luc包括驱动CRE的表达的GVG诱导型启动子系统(Aoyama和Chua，1997)和驱动LUC表达的CaMV 35S启动子，它受到干扰DNA表达盒，一个含有侧接NOS polyA附加序列的两个直接重复lox位点的“填充片段”的转录封闭(附图说明图1)。该系统的工作如下(I)给转基因植物添加化学诱导物，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载体，其含有编码转录因子的第一个基因，可诱导的第二个基因，组成性启动子，第三个基因和位于终止子侧翼的两个重组位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：西蒙盖尔莫勒，左建儒，蔡南海，
申请(专利权)人：洛克菲勒大学，
类型：发明
国别省市：US[]