用于基因修饰非人类动物的新载体制造技术

本发明专利技术涉及一种载体及其用于生产基因修饰的动物和细胞的用途。一方面，本发明专利技术涉及一种载体，其含有一个精细胞及一个或多个通过一个或多个非脂质体基底的连接子结合于精细胞上的聚核苷酸分子。精细胞可以是任何动物的细胞，优选为非人类动物的。在本发明专利技术的一个优选具体实施方案中，所述的一个或多个聚核苷酸分子可以为一种基因产物进行编码，其可赋予细胞或动物所需的特征。在本发明专利技术的另一优选实施方案中，所述的连接子为一种蛋白质或多肽，优选具有精子专一性，例如可与精细胞的外表面结合的抗体。连接子优选为借助离子作用力与一个或多个聚核酸分子发生相互作用。此类相互作用的进行亦可借助其它的分子相互作用，包括使用另一连接子或第二连接子。精子、连接子及一个或多个聚核苷酸的相连亦可发生在生物体外或生物体内。另一方面，在本发明专利技术中，可由具有上述载体的动物卵细胞受精而衍生出基因上修饰的细胞或动物。受精可发生在生物体外或生物体内。在一优选的具体实施例中，基因修饰的发生是因聚核苷酸分子全部或部分地插入至细胞或动物之基因组中。在本发明专利技术的又一方面中，其包括细胞，例如衍生自此类基因上修饰的动物或其后代的精细胞或卵细胞及其细胞系。再一方面，在本发明专利技术中，通过利用具有某些所需特征的上述精子载体，可以得到基因上修饰的动物。此类所需的特征的实施例包括较快的生长速率、抗疾病能力或抗病原体能力、在乳汁中的某些蛋白质的高率以及在动物至人类的外源性移性移植中移植器官的适应性等。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及非人类动物的基因修饰领域。
技术介绍
在过去的二十年间，对动物进行有效的基因修饰，特别对较高等的哺乳动物进行基因修饰，已成为生物科技领域研究者的主要目标。动物的基因修饰，不仅可增进人类对多细胞生物之基因及基因功能的了解，也可应用于生物农业之中。这类应用的实施例包括生产具有所需特征的家畜，例如较快的生长速率、在乳汁中生产治疗性蛋白质，或甚至由动物生产用于动物至人类的、可用于外源性移植(xenotransplantation)的、更“人类化”的器官。现有修饰基因组的技术包括将外来DNA显微注射至受精卵的前核(pronuclei)，经由脂质基底的试剂、电穿孔或病毒感染，将外来DNA在生物体外传送至胚胎干细胞，或在生物体内传送至叶细胞(blastomere)中。然而除老鼠之外，目前所发表的报告在较高等或较大动物上的成功仍属有限，例如曾有报告指出显微注射技术的要求非常苛刻，要求使用高灵敏度及昂贵的设备；也曾报道显微注射的胚胎存活率极低(Wall R.J.等人(1992)，Making Transgenic Livestock，Genetic Engineering on a Large Scale，Journal of Cellular Biochemistry，Vo1.49，pp.133-120)。这使得该领域的研究者去寻找替代的、较容易将基因传送入细胞的方法。1989年，Lavitrano，M.等人报道将外来DNA在老鼠精细胞中进行简单地培养，并在体外有效受精，可生产出基因上修饰的老鼠(Lavitrano，M.等(1989)，Sperm Cells as Vectors for IntroducingForeign DNA into Eggs-Genetic Transformation of Mice，Cell，Vol.57，pp.717-723)。其特征相当于生物技术中之“冷融合”，该报告在此领域中产生相当大的鼓舞(Birnstiel，M.等(1989)，Dangerous LiaisonsSpermatozoa as Natural Vectors for Foreign DNA，Cell，Vol.57，pp.701-702)。然而，据报道，本领域的熟练人员至今仍对Lavitrano的报告有所质疑，因为许多该领域的研究者报道无法重复该实验(Brinster，R.等(1989)，No Simple Solution for Making TransgenicMice，Cell，Vol.59，pp.239-241；Smith，K.(1999)，Sperm Cell MediatedTransgenesisA Review，Animal Biotechnology，Vol.10(1&2)，PP.1-13)。过去十年间，对于使用精子细胞作为将基因转移至动物媒介载体的探索仍持续进行。研究者已阐明精子细胞具有将外来DNA内化(internalize)的固有能力(Francolini，M.等(1993)，Evidence forNuclear Internalization of Exogenous DNA into Mammalian Sperm Cells，Mol.Reprod.Devel.，Vol.34，PP.133-139)。但存在于精液中的某些抑制因子可抑制这种接收DNA的能力(Lavitrano，M.，等(1992)，TheInteraction Between Exogenous DNA and Sperm Cells，Mol.Reprod.Devel.，Vo131，pp.161-169)。此外，导入精细胞的外来DNA也可能经历大规模的DNA重排，因为在成熟的精细胞中，外来DNA的内化可活化这些细胞内某些内源性核酸酶(Maione，B.等(1997)，Activation of Endogenous Nucleases in Mature Sperm Cells uponInteraction with Exogenous DNA，DNA and Cell Biology，Vol.16，pp.1087-1097)。这种重排可使利用此技术的基因上修饰的动物变为无用。其它以精细胞作为载体的工作集中在使用脂质基底的试剂或电穿孔法将外来DNA传送入精细胞中(Smith，同前；Rottamn R.等(1996)，Liposome-mediated Gene Transfer via Sperm Cells.HighTransfer Efficiency and Persi stence of Transgenes by Use of Liposomesand Sperm Cells and a Murine Amplification Element，Journal of AnimalBreeding and Genetics，Vol.113，pp.401-411；PCT Pubications WO99/42569、WO 99/40213及WO 97/11597)。这种方法可能也会遭遇DNA内化以及暴露在可引起所导入的外来DNA重排的核酸酶中的问题。此外，脂质基底的试剂通常具有毒性，且电穿孔需要大量的试验以免精细胞的死亡或丧失活动力。其它技术集中于利用重组病毒的感染，如PCT Publication WO 99/38991中所述，或利用具有微载体(micro-carrier)的“基因枪”，如PCT Publication WO93/24626中所述，以将外来的DNA导入精细胞中。这类技术可能在技术本身上具有挑战性，而且也可能影响精细胞的存活力及活动力；其同样也可能遭遇DNA内化以及暴露在可引起所导入的外来DNA重排的核酸酶中的问题。自1989年以来，研究者发表报告，论述在不同动物中使用精细胞作为载体，这些动物包括昆虫、海洋动物、两棲动物、鸟类及哺乳类(Smith，同前)。然而，很少有人报导此类基因修饰是在活的成熟幼体中观测到的(Smith，同前)。更有问题的事实是一些报告仅使用PCR分析来确认细胞中外来DNA的存在。这些报告整理于Gandolfi，F.的表一中((1998)，Spermatozoa，DNA Binding and TransgenicAnimals，Transgenic Research，Vol.7，PP.147-155)。因为PCR不能区分外来基因的传送是通过附加体(episome)还是通过染色体DNA，Gandolfi质疑这些报告的价值，声称其“展开了一场关于合理评价某些报告所描述的结果的重要辩论”(Gandolfi，同前)。附加体的传送不如染色体传送受欢迎，因附加体可能于随后的细胞分裂中丧失，且所需要的基因修饰的效果可能无法在成年动物中得以表达。由于基因修饰动物特别是高等哺乳动物的简易、无毒及有效的方式，可大幅度改善该领域，因而需要一种使用精细胞传送基因至动物的新方式。专利技术的概述本专利技术是关于一种载体及其在生产基因上修饰的动物及细胞的用途。一方面，本专利技术涉及一种载体，其含有一个精细胞及一个或多个通过一个或多个非脂质体基底的连接子结合于精细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因上修饰非人类之动物或细胞的载体，其包括：一种非人类的精细胞以及至少一种结合于该非人类的精细胞之上的聚核苷酸分子，该结合至少通过一种非脂质体基底的连接子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王康圣，
申请(专利权)人：百圭生物科技公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]