一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的１８６２位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿诱导增强表达的ｂＨＬＨ类转录因子。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种植物磷饥饿诱导转录因子OsPTF1。本专利技术涉及水稻OsPTF1的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白属于bHLH家族类转录因子。本专利技术还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，及这些多聚核苷酸和多肽的应用。
技术介绍
磷作为植物营养的必需元素，在其生长发育过程中起着重要的功能。磷既是植物体内许多重要有机化合物的组成成分，在结构和生理上起着重要作用，同时又以多种方式参与植物体内的各种生理代谢过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢，以及作物的早熟、高产、优质都起着重要的作用。但土壤缺磷是农业生产中普遍存在的限制因素。全世界130亿公顷的土壤中，有18％是酸性土壤，25％是碱性的石灰性土壤。这两种土壤对磷都有固定作用，都属于缺磷性土壤。这种缺磷的现状通常只能通过施用磷肥来解决。但由于磷肥施入土壤后很快就被碱性土壤中的钙盐和酸性土壤中的铁和铝的氢氧化物所固定或被土壤胶体吸附，从而转化为不能为植物所吸收利用的固定态。再加之磷主要通过扩散作用到达根表，而磷的扩散系数又很低，所以施用磷肥的效率一般不超过10％。长期生长在低磷胁迫的环境条件下，高等植物会形成一些耐低磷胁迫的适应性形态及生理生化机制等自我拯救系统，以提高植物在缺磷条件下对磷素的吸收和利用。另外，人们通过对植物耐低磷胁迫能力的基因型差异比较研究发现，植物无论在种间、亚种间还是品系间都存在显著的基因型差异，主要表现在植物对磷的吸收能力、利用效率及对磷的依赖程度等方面。这种植物耐低磷胁迫能力的基因型差异是我们对植物进行遗传基因改良的前提。通过获得参与或调控磷吸收能力、利用效率的基因，进行改造利用，对于提高植物耐低磷能力都有很高的价值。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种分离出的DNA分子，它编码一个bHLH类转录因子。本专利技术的目的之二是提供一种分离出的蛋白质，该蛋白属于bHLH类转录因子。本专利技术的目的之三是提供一种利用分离出的DNA分子或蛋白对植物或细胞进行改造，从而提高植物或细胞对磷饥饿耐受能力的方法。本专利技术还提供了这种分离出的DNA及蛋白的应用。本专利技术第一方面是提供一种分离出的DNA分子，它包含SEQ ID NO1的1862位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿诱导增强表达的bHLH类转录因子。本专利技术第二方面是提供一种分离出的蛋白质及其等价蛋白，它具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，或者与其氨基酸序列至少60％同源的或与其第313-376位氨基酸残基至少有60％的相同性的分离的蛋白质。本专利技术第三方面是提供一种分离出的DNA分子，编码权利要求2的蛋白质的核酸。本专利技术还提供了利用权利要求2和3的蛋白质和核酸获得耐磷饥饿的转基因植物或细胞的方法。本专利技术的优点在于，利用本专利技术提供的基因和技术方法可以提高植物或其细胞的耐磷饥饿能力。例如，利用过表达转基因技术将该基因转化作物如水稻、小麦等，通过提高其耐磷饥饿能力，可达到在不影响产量的前提情况下减少磷肥的施加，从而降低粮食生产成本。附图说明图1是OsPTF1基因的半定量RT-PCR图；图2是OsPTF1的DNA结合分析图；图3是OsPTF1-GFP洋葱表皮细胞瞬时表达核定位分析图；图4是OsPTF1的转录激活分析图；图5是增强表达OsPTF1转基因拟南芥及野生型拟南芥在缺磷情况下的表型图。具体实施例方式本专利技术阐述了一种新的水稻转录因子OsPTF1，它属于basicHelix-Loop-Helix(bHLH)家族成员，该家族都含有bHLH这个结构域，具有该结构域的蛋白主要通过形成二聚体或异源二聚体与DNA序列结合从而调控基因的表达。此基因最初通过构建水稻耐低磷品种Kasalath磷饥饿下的抑制性扣除杂交文库筛选得到的。半定量RT-PCR分析显示OsPTF1在水稻根系为磷饥饿诱导增强表达，而在叶片中为组成型表达。OsPTF1的bHLH结构域位于蛋白序列中部。通过重组OsPTF1-6His蛋白的体外DNA结合实验研究，表明该蛋白可特异性的结合E-box序列(CANNTG)。酵母双杂交分析显示该蛋白的氨基端与GAL4 DNA结合结构域融合能激活转录，表明该蛋白的氨基端具有转录激活功能。利用洋葱表皮细胞的瞬时表达分析发现，35S启动子驱动表达的OsPTF1∷smGFP4融合蛋白进入细胞核内，表明该蛋白为核定位蛋白。这些数据表明OsPTF1为一水稻根系磷饥饿诱导表达的转录因子。在构建了水稻品种Kasalath磷饥饿4天的抑制性差异扣除杂交cDNA文库后，通过利用扣除探针进行筛选，获得一个在水稻根系磷饥饿诱导增强表达的克隆，根据该克隆的序列设计引物进行快速扩增cDNA末端(RACE)，获得该克隆的全长cDNA(SEQ ID No1)，我们命名为OsPTF1，该cDNA编码478个氨基酸(SEQID No2)。与GeneBank相对照探查此推定的蛋白质序列。BLAST探查表明OsPTF1是一种新的蛋白质。此蛋白质的中部靠近-COOH末端发现含有bHLH结构域。由OsPTF1编码的蛋白质的剩余部分与任何已知序列无高度同源。OsPTF1的基因组结构通过对比基因组序列与cDNA序列而分析。OsPTF1基因位于水稻染色体6上，它有8个外显子。进行结构域探查而鉴别了OsPTF1的bHLH结构域内推定的二分核定位信号，此信号序列位于313-327位氨基酸之间。为研究OsPTF1基因在植物磷饥饿胁迫下的作用，设计了一对特异性扩增该基因cDNA序列的引物进行半定量RT-PCR分析。结果发现，该基因在根中为磷饥饿诱导增强表达，而在叶中为组成型表达(图1)。如果bHLH类蛋白作为一类转录因子起作用，通常具有与E-box序列(CANNTG)的结合特性。为测试OsPTF1蛋白是否能特异性结合E-box序列，首先将寡聚的E-box双链用32P末端标记作为探针。同时将OsPTF1克隆入6×His融合载体pET-29b中并转化入大肠杆菌中。纯化重组6×His∷OsPTF1融合蛋白进行分析以测试与DNA的特异结合，如图2所示。OsPTF1蛋白能与E-box序列特异性结合，且该蛋白能特异性的结合CATGTG的E-box序列。由于结构域分析发现OsPTF1具有一个二分核定位信号，表明OsPTF1可能为核定位蛋白。故将OsPTF1按通读框架构建到smGFP4表达载体内，使之能表达一个OsPTF1∷smGFP4融合蛋白。提取该融合表达载体质粒及未改造的smGFP4质粒，用金粉分别包裹，进行基因枪轰击洋葱表皮细胞实验。轰击后于暗环境下培养1天后，用激光共聚焦显微镜观察。结果发现，smGFP蛋白表达后较均匀的分布于整个洋葱表皮细胞内，而OsPTF1∷smGFP4融合蛋白则特异性的分布于核内(图3)。为了检测的OsPTF1激活结构域，我们采用了CLONTECH公司的Matchmaker酵母双杂交系统3。通过将OsPTF1构建到含有GAL4 DNA结合结构域的载体pGBKT7中，同时，依据bHLH结构域所在位置将其分为P1、P2和P3三段后分别构建到pGBKT7中，把这四个载体转化到酵母AH109菌株内，每种转化子都分别在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His的营养缺陷型培养基上生长。结果发现，转化有全长的OsPTF1及本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴平，易可可，吴忠长，吴运荣，周洁，杜黎明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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