基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种生物工程，基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺，其特征是首先进行工程菌发酵扩增，热激诱导，收集菌体。经缓冲液抽提、再经离子交换、分子筛柱层析分离纯化。本发明专利技术具有工艺流程简单、ＳＯＤ半衰期长、产量高、单位成本低等优点，本产品可广泛应用在化妆品、保健食品、医疗等领域。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种生物工程、重组人源铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)的制备工艺。超氧化物歧化酶(SOD)主要有抗衰老、抗炎症、防辐射、抗氧化等功能，可广泛应用于化妆品、保健品、食品、医疗等领域。
技术介绍
目前，国内生产的SOD，主要从天然生物体中提取，其中，以动物血液提取SOD为主，由于血液制品提取的SOD，存在着外源性感染的危险性和非人源制品用于人体有抗原性，在医疗等领域很难发挥其应有的作用。从血液中提取SOD，原料来源有限，成本高、而且人血制品有外源性感染的危险性(如肝炎病毒、爱滋病毒、支原体、衣原体等)。因此不易推广，难以形成批量生产。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺，本工艺原料充足、成本低、无外源性污染的危险性和免疫抗原性。而且生产的SOD活性半衰期长(水剂常温10天，水剂冷冻2年，冰干粉2、5-3年)。这样，应用领域可更加广泛。基因重组人源铜锌SOD的制备工艺其技术方案特点是挑取工程菌单菌落接种在含氨苄的LB培养基斜面培养，然后接种到含AMAP100μg/mlLB培养基的三角瓶中，30℃，180转/分振荡培养10小时，OD值达到1.0时，收集菌液；取菌液以1∶10的比例，接种到含有AMP100μg/ml的改良M9培养基的发酵罐中，30℃培养6小时，OD值达2.5-3.0时，迅速升温至42℃，热激诱导表达，然后在培养3-4小时，离心收集菌体，用0.9％的NaCl洗两次后，再用PH7.8TES缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下搅拌30分钟，加入稀释6倍的TES溶液冰浴条件下搅拌40分钟，离心取上清液，离心的菌体加TES溶液冷冻，取出速暖到冰水混合物状，加入稀释6倍数的TES溶液，搅拌40分钟，离心取上清液，将上述上清液经超滤浓缩，得粗酶液，粗酶液经透析，DEAE-Sephadex-A50离子交换柱层析，使其全部进入胶面，再用Sephadex-200分子筛柱层析，收集Cu、Zn-SOD活力部分。自动馏分收集器收集、冷冻、干燥。目的蛋白以分泌性表达到细菌内膜、外膜之间的周质腔中，并且目的蛋白本身具有生物学活性，不需要进行体外变性，复性处理。因为渗透压法破坏了细胞外膜，所以，目的蛋白经缓冲液抽提，再经离子交换，分子筛柱层析就进一步得到纯化。本专利技术与现有技术相比，由于基因重组人源铜锌SOD，半衰期长，因此，产品质量稳定，还有产量高，成本低、工艺简单等优点。具体实施例方式1、摇床培养挑取工程菌(Cu、Zn-SOD/DH5α)的单菌落接种在含LB培养基(每升含蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，氨基苄100μg/ml，琼脂粉15g)进行斜面培养。然后转入填加AMP100μg/mlLB加培养基的三角瓶中，在30℃振荡培养10小时，OD值达到1、0时，收集菌液。2、发酵缶培养将上述培养的菌液以1∶10的比例，接种于含有改良M9培养基(配方每升含K2HPO46g、KH2PO43g、(NH4)2SO41.5g、NaCl0.5g蛋白胨6g，酵母粉3g、1M MgSO4，葡萄糖10-20g，AMP100μg/ml、Cu2+0.5mM、Zn2+0.01mM)20L发酵缶中，在30℃进行发酵培养5-6小时，OD值达2.5-3.0，迅速升温42℃，热激诱导表达，通过升温，使阻遏蛋白失活，启动子开始启动，SOD蛋白基因开始表达SOD蛋白，再培养3-4小时，细菌生长到平衡期开始放罐，离心，得菌体500g。3、目的蛋白粗提取湿菌体500g，用0.9％的NaCl洗两次，然后用1000ml，PH7.8的TES缓冲液悬浮菌体(TES溶液配方0.2M Tris.HCl，0.5mMEDTA，5M蔗糖)冰浴下搅拌30分钟后，加入稀释6倍的TES溶液化1500ml再悬浮菌体，12000转/分离心，取上清液，把菌体用于500mlTES溶液悬浮冷冻，取出速暖至冰水混合物状，再加入750ml稀释6倍的TES溶液，搅拌40分钟后，12000转/分离心，取上清液备用，再用稀释6倍TES溶液500ML悬浮，12000转/分离心取上清液，合并上清液共4250ml溶液。超滤浓缩至500ml溶液，此即为粗酶液4、目的蛋白的精提DEAE-Sephadex-A50离子交换柱层析。(1)、粗蛋白在PH7.8层析用缓冲溶液10mMPBS(PBS缓冲液配方每升NaH2PO4，NaHPO4)以0.1mM EDTA置于10mMPBS溶液中，粗蛋白在溶液透析过液后，加到PBS平衡过的DEAE-Sephadex-A50柱上，样品全部进入胶面后，再用10mMPBS溶液进行梯度洗脱。收集目的蛋白峰溶液。(2)、Sephadex-G200分子筛柱层析收集DEAE-Sephadex-A50洗脱峰中含有Cu、Zn-SOD的酶液活力部分，用超滤器浓缩，在10mMPBS缓冲液中透析过也夜，样品上柱后用10mMPBS，PH7.8溶液洗脱，自动馏分收集器收集。经离子交换和分子筛柱层析分离后，Cu·Zn-SOD酶纯度可达95％以上，15％PAGE电泳可得单一条带。加入甘露醇即可冷冻干燥得冻干粉。目的蛋白获得率为6.4mg/g菌体，其比活性为1.025万μ/mg(邻苯三酚比色法测活)权利要求1.一种生物工程基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺，其特征是(1)、挑取工程菌单菌落接种在含氨苄的LB培养基斜面培养，然后接种到含AMP100μg/ml的LB培养基的三角瓶中，30℃、180转/分，振荡培养10小时，OD值达到1.0时，收集菌液；(2)、取上述菌液，以1∶10的比例，接种到含有AMP100μg/ml的改良M9培养基的发酵罐中，30℃培养6小时，OD值达2.5-3.0时，迅速升温至42℃，热激诱导表达，然后再培养3-4小时，离心收集菌体；(3)、取菌体，用0.9％的NaCl洗两次，然后用PH7.8TES缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下搅拌30分钟，加入稀释6倍的TES溶液，冰浴条件下搅拌40分钟，离心取上清液，离心的菌体加TES溶液冷冻，取出速暖至冰水混合物状，加入稀释6倍的TES溶液，搅拌40分钟，离心取上清液，将上述，上清液经超滤浓缩，得粗酶液；(4)、粗酶液经透析DEAE-Sephadex-A50离子交换柱层析，其全部进入胶面后，再用PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰溶液，再用Sephadex-200分子筛柱层析，收集含Cu·Zn-SOD酶的活力部分，用PH7.8PBS溶液洗脱，自动馏分收集器收集，冷冻、干燥。2.根据权利要求书1所述的基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶制备工艺，其特征是目的蛋白获得率为6.4mg/克菌体，目的蛋白比活性为1.025万μ/mg。全文摘要本专利技术涉及一种生物工程，基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺，其特征是首先进行工程菌发酵扩增，热激诱导，收集菌体。经缓冲液抽提、再经离子交换、分子筛柱层析分离纯化。本专利技术具有工艺流程简单、SOD半衰期长、产量高、单位成本低等优点，本产品可广泛应用在化妆品、保健食品、医疗等领域。文档编号C07K1/00GK1448507SQ02108299公开日2003年10月15日 申请日期2002年3月29日 优先权日2002年3月29日专利技术者董伟东, 刘兆柯, 路海源 申请人:四平市科本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物工程基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺，其特征是：（１）、挑取工程菌单菌落接种在含氨苄的ＬＢ培养基斜面培养，然后接种到含ＡＭＰ１００μｇ／ｍｌ的ＬＢ培养基的三角瓶中，３０℃、１８０转／分，振荡培养１０小时，ＯＤ值达到１．０ 时，收集菌液；（２）、取上述菌液，以１∶１０的比例，接种到含有ＡＭＰ１００μｇ／ｍｌ的改良Ｍ↓［９］培养基的发酵罐中，３０℃培养６小时，ＯＤ值达２．５－３．０时，迅速升温至４２℃，热激诱导表达，然后再培养３－４小时，离心收集菌体；（ ３）、取菌体，用０．９％的ＮａＣｌ洗两次，然后用ＰＨ７．８ＴＥＳ缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下搅拌３０分钟，加入稀释６倍的ＴＥＳ溶液，冰浴条件下搅拌４０分钟，离心取上清液，离心的菌体加ＴＥＳ溶液冷冻，取出速暖至冰水混合物状，加入稀释６倍的ＴＥＳ溶液，搅拌４０分钟，离心取上清液，将上述，上清液经超滤浓缩，得粗酶液；（４）、粗酶液经透析：ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ５０离子交换柱层析，其全部进入胶面后，再用ＰＢＳ缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰溶液，再用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－２０ ０分子筛柱层析，收集含Ｃｕ.Ｚｎ－ＳＯＤ酶的活力部分，用ＰＨ７．８ＰＢＳ溶液洗脱，自动馏分收集器收集，冷冻、干燥。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：董伟东，刘兆柯，路海源，
申请(专利权)人：四平市科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]