本发明专利技术提供一种以红树等抗旱植物为材料，克隆到抗盐基因ＭＧＸ＃－［４］，将该基因编码序列同强力组成型表达启动子３５Ｓ融合，构建成植物表达载体ｐＨＸＺ，然后借助农杆菌芥导方法，经上述基因表达载体将ＭＧＸ＃－［４］抗盐基因导入被转化的植物染色体基因组内，并使其在转基因植物中大量表达、培养、转基因幼苗转移到生根培养基上诱导生根，两周后将卫生根的幼苗转移到土壤中。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因耐盐抗旱植物，更具体地说转基因西红柿、油菜、烟草等耐盐抗旱植物。世界各国多年来投入了大量的人力和资金，对自然界中的盐生植物进行了大量的研究，企图通过了解这些喜盐植物的抗盐机理，来解决耕地的盐化及干旱地区的生态建设问题。研究发现，这些天然的盐生植物，大致通过以下方式在盐化的土地上生存1.植物具有特殊的根系，在摄取土壤中的养份时，根系不吸取过多的盐份，将盐离子保留在土壤中，不吸收到植物体内；2.植物的叶片形成特殊的一种叫盐腺的结构，将其体内过多的盐份排到体外；3.在植物体细胞内将盐份区域化到特定的区域，如液泡内。以上第一种方式没有多大的应用研究价值，因为植物不吸收土壤中的盐份继续保留在土壤内，从而土地无法脱盐；第二种机理涉及植物体的形态、结构及生理代谢，十分复杂，至今仍无重大进展；第三种机理最具有应用研究价值，但一直未能找到相关的抗盐基因。一直到2001年，本人把从拟南芥菜中克隆的一个相关的基因(AtNHX1)在西红柿及油菜中表达，从而使转基因西红柿及油菜可以在相当于三分之一海水盐浓度的情况下正常生长，转基因抗盐作物才宣告诞生(详见相关论文1.Hong-xia Zhang and EduardoBlumwald，(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulatesalt in foliage but not in fruit.Nature Biotechnology.19(8)765-768；2.Hong-xia Zhang，Joanna N.Hodson，John P.William and EduardoBlumwald(2001)Engineering salt tolerant Brassica plantsCharacterization of yield and seed oil quality in transgenic plantswith increased vacuolar sodium accumulation.Proceedings of theNational Academy of Sciences，USA98(22)12832-12836)。本专利技术涉及的科学术语如下△“转基因”，系指导入植物个体的一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以游离在染色体外，也可以整合到染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。△“类似基因”，系指任何同MGX4的DNA编码序列中任何区域同源性在40％以上的DNA片段，或任何DNA片段，其编码的氨基酸序列同MGX4编码的氨基酸序列中任何区域有40％以上的同源律。类似基因(DNA)片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在体外扩增的。△“基因片段”，系指长度在300个碱基对(bp)以上的同MGX4的DNA序列中的任何域区同源律在40％以上的任何DNA片段，或任何编码100个氨基酸以上的DNA片段，其编码的氨基酸序列同MGX4编码的氨基酸序列中的任何区域同源性在40％以上。该基因片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。△“植物”系指整个植物界包括低等植物、高等植物、藻类以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻类、厥类、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、粮食作物、油料作物、药用植物、苗木、花卉、苗木包括所有木本植物)。△“抗逆植物”，指任何具有抗盐、抗旱、抗寒、抗热、抗虫等特性的植物。本专利技术将MGX4基因(序列附后)在西红柿中表达后，使转基因西红柿可以在相当于二分之一海水盐浓度的营养液中正常生长并结出果实，其抗盐性比已发表的表达拟南芥菜ATNHX1基因的转基因西红柿更好，同时本研究中还将MGX4基因在烟草中表达，使转基因烟草可以在相当于三分之一海水盐浓度的培养基上萌发，并在相当于海水盐浓度的土壤中正常生长。将该MGX4抗盐基因，装配于强力组成型表达的花椰菜花叶病毒35S强力启动子(CaMV35S)之下，构建成可以在植物中表达的载体，通过农杆菌介导的转化方法，使该基因在转基因植株内大量表达，使该基因编码的蛋白(Na+-H+交换泵)的含量大幅度提高，将细胞液中的钠离子“包装”到液胞内，从而使转基因植物获得耐盐抗旱的特性。本专利技术的关键是克隆到了抗盐基因并将其在目的植物中大量表达。由于拟南芥菜并非喜盐植物，为研究开发性能更好的抗盐转基因植物，本专利技术以海生植物红树为材料，克隆到抗盐基因MGX4，该基因编码的蛋白为Na+-H+交换泵，该蛋白定位在植物细胞内的液泡膜上，其功能为将细胞液中的钠离子转移到液泡中，而将液泡内的氢离子交换到液泡外的细胞液中，从而使植物吸收的大量盐份(Na+)区域化到液泡内，而细胞液中Na+的含量保持在较低的水平，各种生理代谢活动可以正常进行，因此表达该基因的植物体具有抗盐特性。MGX4基因的序列如下agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata 600atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctcgaaacacgac 120M S L G I G V L L K S G G A S V S K X D 20ctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgcagctgcattgtcatcaaccac 180L I V S V N I W I A L A C S C I V I N H 40ttgctggatgggaaccgatggctgaacgagtccgccaccgcgcttgtcatgcaactctta 240L L D G N R W L N E S A T A L V M Q L L 60accacaggcgtcatcctgatcgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaac 300T T G V I L I V T N G T N S R I V V W N 80gaggacctgtttttcatatatatacttccgccgttaatcttcaatgtcgggtttcaagta 360E D L F F I Y I L P P L I F N V G F Q V 100aagagaaagcaatggttccgcaactttatacagattattttgttttccgctattagtact 420K R K Q W F R N F I Q I I L F S A I S T 120ctgattggctttgtagcaatctctctttctgcttgtgggttgttcaagaaaatcgatgtt 480L I G F 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用耐盐基因ＭＧＸ↓［４］培育耐盐植物的方法包括：耐盐基因ＭＧＸ↓［４］用该基因的编码序列与强力组成型表达启动子３５Ｓ融合，拼建成植物表达载体ｐＨＸＺ，将其导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中，感染植物子叶或植物外植体，共培养后，再转移到再生培养基上培养，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上诱导生根，有根幼苗转移到土壤栽培得耐盐植物新品种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪霞，
申请(专利权)人：张洪霞，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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