一种抗癌靶向可调控基因－病毒的构建方法技术

本发明专利技术属生物技术领域。本发明专利技术提供了一种抗癌靶向可调控基因－病毒的构建方法。本发明专利技术构建了携带有反式作用元件（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＴＡ）表达盒以及抗癌基因表达盒的无肠腺病毒或ＡＡＶ。这两个表达盒结构相对独立、功能直接相关，使得目的基因的表达受ｈＴＥＲＴ控制仅限于肿瘤细胞并受小分子药物ＲＵ４８６的诱导，需要时打开，不需要时关闭，这样既避免了外源基因产物对正常组织的伤害，也实现了外源基因的长久表达（至少一年以上）。克服了传统的腺病毒载体靶向性差、目的基因表达不受控制以及表达时间短等缺点。本发明专利技术构建的无肠腺病毒载体，可以开发出有效的治疗肿瘤的抗癌新药。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法。野生型腺病毒是一种双链DNA病毒，基因组长度约36kb，分早期和晚期转录区。其早期转录区包含E1-E4基因，编码病毒的调节蛋白；晚期转录区分L1-L5区，编码病毒结构蛋白。目前对人腺病毒2型(adenovirus type2，Ad2)以及人腺病毒5型(Ad5)的研究背景最为清楚，腺病毒载体则以Ad2和Ad5为基础构建而成。重组腺病毒最大包装容量为野生型基因组±5％，即插入外源基因的长度为2kb左右，要插入大片段的外源基因就必须缺失一段腺病毒的基因组成分，缺失太多也不行，那就要补充一些核苷酸片段。第一代腺病毒载体缺失腺病毒基因组的E1区(有时还包括E1与E3区同时缺失)而构建的载体。E1区位于腺病毒基因组1.0-10.6mu处，为病毒复制必需区。缺失E1区的腺病毒只能在有E1区基因产物表达的细胞(如293细胞或其它类似细胞)内复制，因此这样的载体也叫复制缺陷型载体。E1区缺失长度可达3.2kb，E3区也可缺失，缺失长度可达3.1kb。E3区基因是病毒复制的非必需基因，缺失E3区的腺病毒载体仍有复制能力。目前使用的第一代腺病毒载体大多是E1与E3区同时缺失，携带外源基因的容量可达8.3kb。第一代腺病毒载体的基因转移和表达效率很高，但是第一代腺病毒携带外源基因表达的同时也表达一定水平的病毒本身的蛋白，容易引起宿主细胞对病毒蛋白的免疫反应，病毒被清除，外源基因的表达会受到限制，此时用腺病毒载体再次感染时，已经形成的免疫应答会很快地将其清除，使得病毒携带的外源基因无法表达。为了延长腺病毒介导的外源基因表达时间，就必须开发出新的腺病毒载体。第二代腺病毒载体腺病毒的免疫原性主要产生于病毒表达的晚期蛋白，而晚期蛋白的表达在很大程度上受早期基因产物的控制，因此第二代腺病毒载体是在第一代腺病毒载体的基础上又将E2和E4基因进行改造或缺失，削弱早期基因的功能以减少晚期蛋白的表达量。第二代腺病毒为E1、E3缺失同时伴有E2或E4区缺失，因此外源基因的插入量可大到14kb。第二代腺病毒载体虽然在一定程度上降低了自身的免疫原性，但是病毒的复制能力比第一代腺病毒减低了很多，同时载体的免疫原性仍然无法完全消除，而且由于第二代腺病毒的制备方法各不相同、不统一等等，第二代腺病毒还不如第一代腺病毒那样为科学家所青睐，故较少使用。第三代腺病毒载体为无肠腺病毒载体(gutless adenovirus，简称GL-Adv)，它缺失了腺病毒基因组的所有编码区，仅保留有腺病毒的反向末端重复序列(ITR)、病毒包装信号(ψ)。因为腺病毒本身所有的编码区基因已全部被除去，病毒失去了包装能力，为了达到其有效包装长度，还需装入一些无关的DNA序列(如intron)，当再加上外源目的基因后，使病毒基因组的总长度不小于30kb，但又不能超过38kb。由于第三代腺病毒载体完全消除了免疫原性，又可使外源基因能得到长期表达，这些特点使得无肠腺病毒成为了基因治疗的最好载体之一。但是，第三代腺病毒由于缺失了基因组的所有编码区，病毒本身不能复制，产生子代病毒粒子必须是在特殊的包装细胞内、并有辅助病毒的参与才能完成。目前用于无肠腺病毒包装的细胞系是293Cre4，它是在普通的293细胞系中转入Cre重组酶基因，使该细胞系能稳定表达重组酶。Cre重组酶能识别大小为34bp的loxP序列，如果某基因或某一DNA片段的两端各有一loxP序列，在有Cre重组酶存在的情况下，由于loxP序列会发生同源重组，该基因或DNA片段被剪切下来，如图2所示。用于无肠腺病毒包装的辅助病毒是helper virus H14，该病毒与第一代腺病毒基本一致，所不同的是在其基因组的包装信号(ψ)两端各加一拷贝的loxP序列，当病毒感染293Cre4细胞时，细胞内的Cre重组酶会将包装信号(ψ)切掉，辅助病毒不能包装，但当有无肠腺病毒同时感染时，辅助病毒所产生的晚期蛋白可用于无肠腺病毒的包装，而辅助病毒因为本身的包装信号被切掉，不能被包装成病毒。第一代腺病毒由于有一定的抗原性，进入机体后易被血清中抗体所清除，病毒在体内存留时间仅能维持1-2个月。为了达到外源基因长期表达的效果，我们使用了第三代腺病毒载体。
技术实现思路
本专利技术地目的就在于克服肿瘤基因治疗中所使用的第一代腺病毒载体具有免疫原性强的缺点，取而代之以无免疫原性的无肠腺病毒或免疫原性极小的AAV载体，使无肠腺病毒或AAV载体不受机体免疫系统的攻击，进而使所携带的外源基因能长久有效地在肿瘤中表达。腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)是免疫原性极小、可以长期使用而不会失活的载体，但是过去制备不过关，得不到高滴度的AAV，现已过关，可以用于临床，因此，在本专利技术中，AAV可与无肠腺病毒平行使用，作为我们下面两个表达盒的载体如附图说明图1所示，第一个表达盒为反式作用元件(trans-activator，TA)表达盒，在本专利技术中称之为表达盒-1；第二个表达盒为抗癌基因表达盒，在本专利技术中称表达盒-2。本专利技术所采用的技术方案就是在无肠腺病毒或AAV载体上装入表达盒-1及表达盒-2。表达盒-1的构成是(1)肿瘤组织特异性启动子；(2)反式作用元件(trans-activator，TA)，TA的构成依次是源于酵母的GAL4因子DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子NF-kB的p65亚基基因片段以及终止信号。表达盒-1有如下特点使用肿瘤组织特异性启动子控制该表达盒的表达，使该表达盒的TA特异性地在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞内不表达。本专利技术所使用的肿瘤组织特异性启动子可以是下述的任何一种端粒酶逆转录酶催化亚基基因启动子。甲胎蛋白(AFP)启动子。癌胚抗原(CEA)启动子。前列腺特异性抗原启动子。乳腺癌组织特异性启动子。受肿瘤组织特异性启动子控制的反式作用元件TA表达盒由来源于酵母的GAL4因子DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子NF-kB的p65亚基基因片段及终止信号组成。表达出的TA是一个嵌和体蛋白，其中的GAL4结合片段可以结合17mer x4序列，突变的孕酮受体片段不会结合内源性的正常配体，但是可以结合RU486(或mifepristone)，结合RU486以后，孕酮受体片段构象发生改变，使得整体嵌和体蛋白具备与GAL4启动子17mer x4序列结合的特点，进而启动转录的活性。而未与RU486结合的孕酮受体构象不发生改变，整体嵌和体蛋白不具备转录激活作用。因此，反式作用元件(TA)活性的发挥受双重因素的调控在转录与翻译水平上受肿瘤组织特异性启动子的调控，在功能发挥上又受小分子药物RU486的调控。GAL4是源于酵母的转录调控因子，与人的亲源关系相差甚远，不会识别人源的转录调控区，因此避免了反式作用元件(TA)对人体内其他基因的干扰。表达盒-2的构成是(1)源于酵母的GAL4上游序列(USA)17-mer，为了提高效率使用4个17-mer(17-mer x4)；(2)TATA盒；(3)位于TATA盒下游的抗癌基因；(4)终止序列。表达盒-2具有如下特点该表达盒中抗癌基因的表达仅受活化的反式作用元件(trans-act本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗癌靶向可调控基因－病毒的构建方法，其特征在于包括下列步骤：一、克隆质粒ｐＲＳ－ｈＴＥＲＴ／Ｔｒａｉｌ的构建反式作用元件表达盒，即表达盒－１的构建：用限制性内切酶消化质粒ｐＡｄ／ｈＴＥＲＴ，回收ｈＴＥＲＴ启动子片段再插入到克隆载 体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的多克隆位点，得到ｐＢＳ－ｈＴＥＲＴ；用限制性内切酶切割ｐＢＳ－ｈＴＥＲＴ，将含有ｈＴＥＲＴ启动子片段克隆到ｐＲＳ－１７的相应位点，替换出ｐＲＳ－１７原有的ＴＴＲ启动子，得到质粒ｐＲＳ－ｈＴＥＲＴ；抗癌基因表达盒 ，即表达盒－２的构建：从ｐＣＡ１３－Ｔｒａｉｌ中用限制性内切酶切出Ｔｒａｉｌ基因，克隆到中间载体的相应位点，然后再通过基因克隆的方法插入ｐＲＳ－ｈＴＥＲＴ的ＣｌａＩ位点，得到克隆质粒ｐＲＳ－ｈＴＥＲＴ／Ｔｒａｉｌ；二、包装质粒ｐＧＬ－ｈ ＴＥＲＴ／Ｔｒａｉｌ的构建用限制性内切酶把克隆质粒ｐＲＳ－ｈＴＥＲＴ／Ｔｒａｉｌ的两个表达盒切出，连接到质粒ｐＧＬ的酶切位点上，得到包装质粒ｐＧＬ－ｈＴＥＲＴ／Ｔｒａｉｌ；三、病毒的包装用限制性内切酶切割包装质粒ｐＧＬ－ｈＴＥＲ Ｔ／Ｔｒａｉｌ使之线性化，与辅助病毒共转染到包装细胞２９３Ｃｒｅ４中；四、病毒的收集纯化挑选单克隆，鉴定后大规模培养，收集细胞培养物，经梯度离心纯化病毒。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：裴子飞，李兵华，邹卫国，孙兰英，顾锦法，刘新垣，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]