碱性纤维素酶变异体制造技术

本发明专利技术提供通过用另一种氨基酸取代在具有与ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１中所示的氨基酸序列表现出至少９０％同源性的氨基酸序列的纤维素酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的碱性纤维素酶变异体，所述的氨基酸残基位置为ＳＥＱＩＤＮＯ：１中的：（ａ）第１０位，（ｂ）第１６位，（ｃ）第２２位，（ｄ）第３３位，（ｅ）第３９位，（ｆ）第７６位，（ｇ）第１０９位，（ｈ）第２４２位，（ｉ）第２６３位，（ｊ）第３０８位，（ｋ）第４６２位，（ｌ）第４６６位，（ｍ）第４６８位，（ｎ）第５５２位，（ｏ）第５６４位，或（ｐ）第６０８位；编码所述变异体的基因；包含所述基因的载体；包含所述载体的转化体和包含所述碱性纤维素酶变异体的洗涤剂组合物。本发明专利技术提供了能在碱性范围有效发挥作用的碱性纤维素酶，并且由于其具有高效分泌能力或具有增强的比活性可迅速大量地生产。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可掺入到洗涤剂等中的纤维素酶变异体。近来遗传工程的发展使大规模地生产洗涤剂酶成为可能，并可将其应用于碱性纤维素酶的生产。目前已克隆了大量的碱性纤维素酶基因，并确定了其核苷酸序列。而且，已引入了酶产生菌的诱变和育种技术、或所述酶编码基因的诱变技术。然而，它们在工业规模生产上的产率未能达到令人满意的水平，因此仍然需要能高效生产的碱性纤维素酶。因此，本专利技术的目的是提供能在碱性范围有效发挥作用的碱性纤维素酶，并且由于其具有高效分泌能力或具有增强的特异活性可迅速大量地生产。本专利技术的一方面提供，通过用另一种氨基酸取代在具有与SEQ.ID.NO1中所示的氨基酸序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的纤维素酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的碱性纤维素酶变异体，所述的氨基酸残基位置为SEQ ID NO1中的(a)第10位，(b)第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468位，(n)第552位，(O)第564位，或(p)第608位；以及编码该碱性纤维素酶变异体的基因。本专利技术的另一方面提供包含上述基因的载体，和含有所述载体的转化体。本专利技术的又一方面提供掺入了上述碱性纤维素酶变异体的洗涤剂组合物。具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列表现出至少90％同源的氨基酸序列、作为亲本碱性纤维素酶的碱性纤维素酶包含具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的碱性纤维素酶，和具有与上述序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的碱性纤维素酶。它们可以是野生型的碱性纤维素酶也可以是野生型的变异体。优选的，其具有经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或凝胶过滤测定的86,000±2,000的分子量，当以羧甲基纤维素作为底物时最佳的pH值为7.5到9.5；最适温度为40到50℃；除羧甲基纤维素外可顺利地降解地衣淀粉；在pH9、50℃条件下温育10min能保持足够的稳定。特别优选的是具有下述性质的纤维素酶，该纤维素酶分子量为86,000±2,000(通过SDS-PAGE或Sephacryl S200柱凝胶过滤)；最佳反应pH8.6到9.0；最适反应温度50℃；和羧甲基纤维素一样顺利地降解地衣淀粉；在50℃、pH9、存在5mM氯化钙的条件下处理10min后的剩余活性为95％或更高(估计在30℃条件下处理10min后的剩余活性为100％)。＂具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的碱性纤维素酶＂的例子包括 Egl-237(来自芽孢杆菌种的菌株KSM-5237(FERM BP-7875)，Hakamada，et al.，Biosci Biotechnol.Biochem.，64，2281-2289，2000]。＂具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的碱性纤维素酶＂的例子包括，具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列优选至少95％、更优选至少98％同源的氨基酸序列的碱性纤维素酶。特定的例子包括来自芽孢杆菌种的菌株1139(Egl-1139)(Fukumori，et al.，J.Gen.Microbiol.，132，2329-2335)(91.4％同源性)的碱性纤维素酶，来自芽孢杆菌种的菌株KSM-64(Egl-64)(Sumitomo，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，872-877，1992)(同源性91.9％)碱性纤维素酶和来自芽孢杆菌种的菌株KSM-N131(Egl-N131b)(日本专利申请No.2000-47237)(同源性95.0％)。氨基酸序列的同源性可以利用程序，如最大值匹配或搜索GENETYX-WIN同源性(Software Development Co.)来计算。具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的亲本碱性纤维素酶的(a)到(p)位氨基酸残基是(a)第10位的亮氨酸，(b)第16位的异亮氨酸，(c)第22位的丝氨酸，(d)第33位的天冬酰胺，(e)第39位的苯丙氨酸，(f)第76位的异亮氨酸，(g)第109位的甲硫氨酸，(h)第242位的谷氨酰胺，(i)第263位的苯丙氨酸，(j)第308位的苏氨酸，(k)第462位的天冬酰胺，(l)第466位的赖氨酸，(m)第468位的缬氨酸，(n)第552位的异亮氨酸，(o)第564位的异亮氨酸，和(p)第608位的丝氨酸。在具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的亲本碱性纤维素酶中，相应于上述的SEQ.ID.NO1(a)到(p)位的氨基酸残基优选的是(a)第10位的亮氨酸，(e)第39位的苯丙氨酸，(f)第76位的异亮氨酸，(h)第242位的谷氨酰胺，(i)第263位的苯丙氨酸，(k)第462位的天冬酰胺，(l)第466位的赖氨酸，(m)第468位的缬氨酸和(n)第552位的异亮氨酸，其中，除上述的氨基酸残基外，具有(b)第16位的异亮氨酸和(c)第22位的丝氨酸的亲本碱性纤维素酶是更优选的，除这些氨基酸残基外具有，(d)第33位的天冬酰胺，(g)第109位的甲硫氨酸，(j)第308位的苏氨酸，(o)第564位的异亮氨酸，和(p)第608位的丝氨酸的那些是更优选的。因此，具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的亲本碱性纤维素酶优选具有上述酶学性质，和/或具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列优选至少95％，更优选至少98％同源的氨基酸序列，而且具有相应于上述SEQ.ID.NO1中(a)到(p)位的氨基酸残基。特别优选的是具有上述酶学性质，具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列优选地至少95％，更优选至少98％同源的氨基酸序列，而且具有相应于上述SEQ.ID.NO1中(a)到(p)位的氨基酸残基的纤维素酶。当将具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的纤维素酶用作亲本碱性纤维素酶时，本专利技术的碱性纤维素酶变异体具有在(a)到(p)中任意位置发生取代的氨基酸序列，而将具有与SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的纤维素酶(除SEQ ID NO1所示的碱性纤维素酶之外)用作亲本碱性纤维素酶时，位于相应于上述SEQ.ID.NO1中(a)到(p)位的任意一个位置的氨基酸残基被另一种氨基酸残基所取代。对于另一种氨基酸，谷氨酰胺，丙氨酸，脯氨酸或甲硫氨酸，尤其是谷氨酰胺优选位于位置(a)，天冬酰胺或精氨酸，尤其是天冬酰胺优选位于位置(b)，脯氨酸优选位于位置(c)，组氨酸优选位于位置(d)，丙氨酸，苏氨酸或酪氨酸，尤其是丙氨酸优选位于位置(e)，组氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，苏氨酸或丙氨酸，尤其是组氨酸优选位于位置(f)，异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸或缬氨酸，尤其是异亮氨酸优选位于位置(g)，丙氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸或甘氨酸，尤其是丙氨酸，苯丙氨酸或丝氨酸优选位于位置(h)，异亮氨酸，亮氨酸，脯氨酸或缬氨酸，尤其是异亮氨酸优选位于位置(i)，丙氨酸，丝氨酸，甘氨酸或缬氨酸，尤其是丙本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过用另一种氨基酸取代在具有与ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１中所示的氨基酸序列表现出至少９０％同源性的氨基酸序列的纤维素酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的碱性纤维素酶变异体，所述的氨基酸残基位置为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中的：（ａ）第１０位，（ｂ）第１６位，（ｃ）第２２位，（ｄ）第３３位，（ｅ）第３９位，（ｆ）第７６位，（ｇ）第１０９位，（ｈ）第２４２位，（ｉ）第２６３位，（ｊ）第３０８位，（ｋ）第４６２位，（ｌ）第４６６位，（ｍ）第４６８位，（ｎ）第５５２位，（ｏ）第５６４位，或（ｐ）第６０８位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：袴田佳宏，泽田和久，远藤圭二，児玉裕司，和田恭尚，四方资通，小林彻，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]