分离双能肝祖细胞的方法技术

建立了获得富含肝祖细胞的细胞混合物的方法，包括产生多种类型细胞混合物悬液的方法，以及筛选那些经典ＭＨＣＩ类抗原阴性和ＩＣＡＭ－１抗原阳性的细胞。非经典ＭＨＣＩ类抗原的弱或微弱表达可被用来进一步富集肝祖细胞。此外，祖细胞可以因具有一定水平的侧向散射而被选择，这是粒度或细胞质滴的测定法，祖细胞比非实质细胞如造血细胞高，比成熟的实质细胞如肝细胞低。而且，分离的祖细胞的后代可以表达甲胎蛋白和／或白蛋白和／或ＣＫ１９。如此分离的肝祖细胞可以无性繁殖地生长，即一整群后代可以来自一个细胞。祖细胞克隆在培养中具有成堆或成团聚集的生长特征。这些分离肝祖细胞的方法可应用在包括人的任何脊椎动物。预期肝祖细胞群可用于细胞治疗、生物人工肝脏、基因治疗、开发疫苗、以及众多的毒理学、药理学和药剂学项目和研究。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及区分肝细胞和造血细胞的新的细胞表面标记物。特别是，本专利技术涉及用独特的表现型，包括经典的主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原阴性的细胞、细胞间粘附分子1(ICAM-1)阳性的细胞、以及非经典MHC I类抗原微弱阳性的细胞。此外，本专利技术涉及通过本专利技术方法产生的肝祖细胞和肝干细胞。2.
技术介绍
在哺乳动物组织中识别多潜能祖细胞群对于临床和商业目的都是重要的，对理解发育过程和组织内环境平衡也是重要的。祖细胞群是基因治疗、细胞移植和生物人工器官组织工程的理想靶标(Millar，A.D.1992 Nature 357，455；Langer，R.和Vacanti，J.P.1993 Science260，920；Gage，F.H.1998 Nature 392，18)。从对造血干细胞(Spangrude等人.1988 Science 241，58)、神经干细胞(Davis，A.A.，和Temple，S.1994 Nature 372，263；Stemple，D.L.，和Anderson，D.J.1992 Cell 71，973)和表皮干细胞(Jones，P.H.，和Watt，F.M.1993 Cell 73，713)的研究中，很容易地看到存在组织特异的、“决定的”干细胞或具有高度生长潜能和/或多种潜能的祖细胞，它们每一个都已经采用该组织适用的特定方法被克隆地识别。这些祖细胞被认为是负责正常的造血、神经和表皮组织内环境平衡和严重创伤后再生反应的细胞(Hall，P.A.，和Watt，F.M.1989 Development106，619)。尽管肝脏通常是静止的组织不需快速的更新，但哺乳动物的成年肝脏在广泛的肝毒性损伤或部分肝切除后，具有巨大的恢复能力(Fishback，F.C.1929 Arch.Pathol.7，955)；(Higgins，G.M.，和Anderson，R.M.1931 Arch.Pathol.12，186)。最近通过连续的移植实验检测得到的来自小鼠的数据已被阐明，提示成年实质细胞具有几乎无限的生长潜能(Overturf等人，1997 Am.J.Pathol.151，1273)；(Rhim，J.A.等人，1994 Science 263，1149)。这些实验利用限制该能力的不均一肝细胞群来证实在成年实质细胞、成年实质细胞亚群和/或非实质细胞(即祖细胞)中观察到的生长潜能。此外，研究显示没有胆管上皮分化的证据，因为所用的宿主是白蛋白-尿激酶转基因的，或在另外的情况下是酪氨酸分解酶缺陷的；两种类型的宿主都具备选择肝细胞系的条件。因此，该实验不能检测双能细胞群。数个组织学研究确定来自妊娠中期胚胎的早期肝细胞具有分化成胆管上皮以及成熟肝细胞的发育性双向潜能(Shiojiri，N.1997Microscopy Res.Tech.39，328-35)。肝脏发育始于腹侧前肠内胚层，在内胚层上皮与发生心脏的中胚层接触后即刻开始(Douarin，N.M.1975 Medical Biol.53，427)；(Houssaint，E.1980 CellDiffer.9，269)。在小鼠，肝脏定型发生在第8胚胎日(E)。最初阶段的肝脏发育以在内胚层诱导血清白蛋白和甲胎蛋白mRNAs而显现，且在形态学改变之前(Gualdi，R.等人，1996 Genes Dev.10，1670)。在小鼠妊娠期的E9.5天，特化的细胞在那时增殖并以索状方式穿入原始横隔的间叶组织中，形成肝原基。尽管肝脏体积在那时显著地增加，但体积增加主要地是由于造血细胞，该细胞在小鼠E10天转移至胎肝(Houssaint，E.1981 Cell Differ.10，243)，并影响肝细胞使之显示成极其扭曲和不规则的形状(Luzzatto，A.C.1981 Cell TissueRes.215，133)。有趣的是，最近来自基因定向突变小鼠的数据显示，许多基因的损伤在E12至E15期间引起致死性肝衰竭、凋亡和/或实质细胞坏死(Gunes，C.等人，1998 EMBO J.17，2846；Hilberg，F.等人，1993Nature 365，1791；Motoyama，J.等人，1997 Mech.Dev.66，27；Schmidt，C.等人，1995 Nature 373，699)。特别地，应激活化的级联(Ganiatsas，S.等人，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，6881；Nishina，H.等人，1999Development 126，505)或抗凋亡级联(Beg，A.等人，1995 Nature376，167；Li，Q.等人，1999 Science 284，321；Tanaka，M.等人，1999.Immunity 10，421)之一部分的基因破坏可以引起严重的肝发育损害，没有造血作用，尽管有广泛的失活基因表达。不清楚是否肝细胞对发育应激刺激固有地敏感，或是特定的胎肝微环境本身引起这种破坏性作用(Doi，T.S.等人，1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2994)。另一方面，成年肝脏的基本结构有赖于最初围绕门静脉的胆管上皮柱的出现(Shiojiri，N.1997 Microscopy Res.Tech.39，328)。免疫组织化学上，肝内胆管上皮细胞分化的第一个信号是表达胆管特异的细胞角蛋白(CK)。CK蛋白，即上皮细胞的胞浆中间丝(IF)蛋白，是由多基因家族编码的并以组织和分化特异的方式表达(Moll，R.等人，1982Cell 31，11)。CK19是最显著的胆管标记物之一，因为成年肝细胞完全不表达CK19，而成年胆管上皮细胞表达此蛋白。只有CK8和CK18从早期肝细胞到成年肝细胞均表达(Moll，R.等人，1982 Cell 31，11)。在大鼠发育的E15.5天，相对于小鼠的E14天，胆管前体细胞被CK18和CK8抗体均重染，一些胆管前体细胞表达CK19。随着发育的进程，成熟的胆管逐渐表达CK19外还表达CK7，并丧失白蛋白的表达(Shiojiri，N.等人，1991 Cancer Res.51，2611)。尽管早至E13天的大鼠肝细胞被认为是同质的群体，但仍然要看是否所有的早期肝细胞可以分化成胆管上皮细胞系，以及它们的结局是任何确定的。确定性种系标记研究，如采用逆转录酶病毒载体者，还没有对肝细胞进行，而且对于确定任何双能肝祖细胞所必需的纯系生长条件尚未确定。对于纯系生长分析，一个主要障碍是造血细胞的过度生长，这妨碍了观察肝细胞离体扩张的能力。因此，必须使用一个肝细胞群富集步骤。尽管能够在胎肝中分离造血细胞的表面标记物已经被详细研究(Dzierzak，E.等人，1998 Immunol.Today 19，228-36)，但用于肝祖细胞者仍然缺少详细说明，因为该研究仍处于初期阶段(Sigal，S.等人，1994 Hepatology 19，999)。因此，通常用于成体肝细胞的离体增殖条件可引起其去分化，并丧失组织特异的功能如表达白蛋白(Block，G.D.等人，1996 J.Cell Biol.132，1133)。只有在没有血清且有限定的激素、生长因子和/或某本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含双能肝祖细胞的组合物，该祖细胞至少表达一种细胞间粘附分子（ＩＣＡＭ）抗原，不表达主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）Ｉａ类抗原，其中所述的双能肝祖细胞具有分化能力。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：H库博达，LM里德，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]