一种用作人用治疗性疫苗佐剂的质粒制造技术

本发明专利技术提供一种将具有免疫刺激作用的寡核苷酸序列（ＯＤＮ）与特定载体结合，制备高拷贝、能够稳定存在的质粒，质粒中的ＯＤＮ不经过硫代磷酸修饰就有效激活免疫细胞，该质粒能够作为疫苗佐剂，尤其是能够作为治疗包括乙型肝炎等慢性传染病和肿瘤的治疗性疫苗的佐剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于遗传工程，涉及疫苗和核苷酸分子。本专利技术涉及将具有免疫刺激作用的寡核苷酸序列(ODN)与特定载体结合，制备高拷贝、能够稳定存在的质粒，该质粒能够作为疫苗佐剂，尤其是能够作为治疗慢性传染病和肿瘤的治疗性疫苗的佐剂。由于其能有效刺激和活化免疫细胞，上述ODN对于开发新的人用免疫佐剂有较好的应用前景。以K型或D型ODN为佐剂进行的小鼠、恒河猴和黑猩猩的动物实验表明，ODN可以显著增强抗原诱导的体液和细胞免疫应答，而且安全性好，并且D型ODN作为疫苗佐剂所取得的免疫保护效果优于K型ODN。但是，目前的ODN专利技术都有一些问题。比如有的专利技术(人CpG寡脱氧核苷酸对质粒DNA免疫刺激活性的影响，中华医学杂志2002年第82卷第7期)先构建含有卡那霉素抗性基因和puc质粒复制起始点的质粒pMini，再分别向该质粒中插入9和16个拷贝可刺激人免疫细胞的K型寡脱氧核苷酸CpG 2006，发现随着插入CpG 2006拷贝数的增加，质粒在体外活化小鼠脾细胞分泌抗体的能力逐渐增强，但诱生IFN-γ的能力逐渐降低。用质粒作为乙肝表面抗原HBsAg的佐剂免疫小鼠，能明显提高小鼠的抗体水平，其功能在于对于体液免疫应答有促进作用，而对于细胞免疫应答的促进作用不明显，此外，K型寡脱氧核苷酸只有经过硫代磷酸的修饰才有好的免疫刺激作用，而质粒在大肠杆菌杆菌中复制，不能进行硫代磷酸修饰，这也大大降低了其免疫刺激作用。使用卡那霉素抗性基因作为原核筛选标记，虽然符合美国FDA关于人用质粒的原核筛选标记要求，但卡那霉素抗性基因本身的分子量较大，插入16个拷贝寡脱氧核苷酸的质粒分子达到2150个脱氧核苷酸对。用合成的含CpG的寡脱氧核苷酸加入商业化的乙型肝炎疫苗接种对该疫苗反应极低的猩猩，结果在表明在疫苗中加入CpG寡脱氧核苷酸可显著提高猩猩的血清抗体阳转率和抗体滴度，表明CpG寡脱氧核苷酸作为疫苗佐剂可能作为乙型肝炎治疗有重要的应用价值。分别用K型和D型含CpG的寡脱氧核苷酸作为利什曼原虫疫苗佐剂免疫恒河猴，检测恒河猴外周血单核细胞对利什曼原虫抗原的反应，结果K型CpG为佐剂免疫猴的外周血单核细胞能分泌高水平IL-6，而D型CpG为佐剂免疫猴的外周血单核细胞能分泌高水平IFN-γ。用活利什曼原虫攻击免疫的恒河猴，结果D型CpG为佐剂的免疫保护效果优于K型CpG为佐剂的免疫保护效果。以上在灵长类动物的实验表明用含CpG的寡脱氧核苷酸作为疫苗佐剂能大大提高疫苗的免疫效率，对于一些用常规佐剂免疫效果差的疫苗或者作为治疗性疫苗的免疫佐剂有着很好的发展前景。相关的文献均为用质粒作为DNA疫苗，而非作为单纯的免疫佐剂，或者用人工合成的寡脱氧核苷酸作为疫苗佐剂，未发现构建含有多拷贝免疫刺激寡脱氧核苷酸的质粒，以之作为疫苗佐剂的报道或专利。专利技术目的本专利技术的目的首先在于提供一种可以作为疫苗佐剂的寡脱氧核苷酸；其次是提供一种制备简单、稳定的寡脱氧核苷酸，尤其是提供一种以质粒形式存在的、能够在肿瘤和慢性传染病治疗性疫苗中使用的质粒；本专利技术的目的还包括提供非经过硫代磷酸修饰就有效激活免疫细胞，且在质粒中达到了多拷贝，更有效激活细胞免疫应答的治疗性疫苗佐剂。技术方案本专利技术使用了3种可刺激人体细胞免疫应答的D型ODN作为佐剂单元，构建成了一种含有多拷贝D型ODN的质粒。选择D型ODN而不选择K型ODN作为免疫刺激单位，是基于以下原因1，D型ODN能而K型ODN不能有效刺激单核细胞分化为树突状细胞，而树突状细胞为最强的抗原提呈细胞，对于激发细胞免疫应答尤其重要。2，D型ODN能而K型ODN不能活化NK细胞及促进其分泌IFN-γ，FN-γ能诱导静止性CD4+T淋巴细胞向Thl型分化和增强CD8+T淋巴细胞的细胞毒活性，还可直接抑制病毒的增殖和肿瘤细胞的分裂。而慢性病毒感染者和肿瘤患者均表现为细胞免疫应答无能，增强其细胞免疫应答是公认有效的免疫治疗方法。3，K型ODN需要硫代修饰才有效，这对于在细菌中自身复制的质粒是不可实现的。4，D型ODN也能有效增强体液免疫应答，提高机体的抗体反应。我们选择的D型ODN包括以下3种，均可激活人类免疫细胞。5’-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3’，5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3，5’-ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG-3，本专利技术的D型ODN能够促进NK细胞分泌IFN-γ和促进单核细胞分化为树突状细胞，因此能增强细胞免疫应答，更合适用于治疗性疫苗的佐剂，对于慢性病毒感染和肿瘤有应用价值。以supF基因作为原核筛选标记，分子量小，插入30个拷贝寡脱氧核苷酸的质粒分子由1796个脱氧核苷酸对组成。技术效果构建的质粒pCG30含有3种已经证明对人免疫细胞有高效激活作用的D型寡脱氧核苷酸，共30个拷贝，以其作为佐剂克服了用合成的寡脱氧核苷酸作为佐剂的不利。合成的寡脱氧核苷酸是单链DNA，即使末端的脱氧核苷经过硫代磷酸修饰，在体内也易被降解，而将整个单链进行硫代磷酸修饰又大大降低了D型寡脱氧核苷酸的免疫激活作用，而质粒是双链DNA，在体内的稳定性大大提高，此外，用这种质粒作为佐剂，使得制备过程极为简单，大大降低了成本。将多拷贝的寡脱氧核苷酸集中于一个能在大肠杆菌中自主复制且纯化方便的质粒，不仅有免疫刺激活性，而且稳定性好，成本低廉，有很大的应用价值。含有多拷贝具有免疫刺激活性的核苷酸序列，可作为人用疫苗佐剂，尤其可作为慢性病毒感染和肿瘤的治疗性疫苗佐剂；该类质粒不含有任何病毒相关核酸序列，安全性好；可以用四环素筛选，符合美国FDA关于人用质粒的有关筛选标志的要求；该质粒的分子量小，佐剂成分含量高。目的基因与T克隆载体pMD18T连接在0.5毫升离心管建立以下反应体系回收的PCR反应产物 6μl5×T4DNA连接酶缓冲液 2μlT克隆载体pMD18T1μlT4 DNA连接酶(2U/μl) 1μl混匀，置于16℃水浴16小时，取5μl转化感受态大肠杆菌DH5α，得到的氨苄青霉素抗性菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB液体培养基，再提取重组质粒进行酶切鉴定，命名为pMD18T-puc ori。PCR扩增tRNA抑制子supF基因引物35’-GAATTCGGATCCGATTACCGCGGTCTTTCTC-3’引物45’-CTCGAGTCTAGAAAGCAGGGAGCAGATTC-3’用质粒pcDM8为模板扩增tRNA抑制子supF基因，扩增产物回收后与T克隆载体pMD18T连接，得到重组质粒pMD18T-supF，方法同上。免疫刺激ODN的拼接合成的ODN15’GTCGACTCTAGAAGCTTGGATCCGGTGCATCGATGCAGGGGGGGATGGGGGGACGATCGTCGGGGGGACCGAIAACGTTGCCGGTGACGGCAC-3’合成的ODN25’GCTAGCTCGAGCTGCAGAATTCCCCCCGACGATCGTCCCCCCATCCCCCCCTGCATCGATGCACCCATCGTGGTGCCGTCACCGGCAACGT-3’合成的ODN35’-GTCGACTCTAGAAGCTTG-3’合成的ODN45’-GCTAGCTCGAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒，其特征是由多拷贝的具有免疫刺激活性的核苷酸序列和载体序列组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵平，戚中田，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]