高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒及其用途制造技术

本发明专利技术提供了高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞特异性增殖的病毒及其用途。该病毒能并且基本上限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。通过将编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列插入所述肿瘤细胞内增殖的病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加，从而在肿瘤细胞高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段，抑制肿瘤的生长及转移。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途。但目前对于抗体治疗实体瘤仍存在着两个难题1.由于实体肿瘤的细胞被致密的基质包裹，抗体难以穿透这一屏障而到达肿瘤细胞；大多数实体肿瘤有淋巴回流障碍，导致间质内压力升高，因而阻止了抗体由血液中进入肿瘤实质；小部分进入肿瘤内部的抗体，首先遇到血管周围的肿瘤细胞而被结合，使得抗体无法到达距离血管较远的肿瘤细胞。2.由于治疗肿瘤的抗体需要量极多，目前的生物工程生产比较困难；同时由于需要量极多，要求其产品纯度极高，因此价格非常昂贵。故目前应用抗体治疗大体积的实体肿瘤的疗效仍不理想，很多研究建议对于实体肿瘤的抗体治疗主要应用于肿瘤的微小残留或微转移灶中，但这种疾病的治疗需要长时间及大规模的多中心临床试验才能评估其疗效，这也使抗体在实体瘤的临床应用及推广产生一定的限制作用。众所周知，长期以来，肿瘤基因治疗的方法存在着基因的转染有效率和抗癌基因的表达量均较低的缺陷。而肿瘤特异性增殖病毒的治疗方法是利用该类病毒只能特异性地在肿瘤细胞内复制和增殖的性质，随着病毒在肿瘤细胞内的复制和增殖导致肿瘤细胞裂解，释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，使得病毒弥散到全身各个组织及脏器，感染所有组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤。由于肿瘤增殖病毒基本上不能在正常细胞中增殖，所以不影响肿瘤细胞周围的正常细胞。但单独应用肿瘤增殖病毒治疗仍有局限性，首先，肿瘤形成的机制非常复杂，异质性非常强，病人与病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显差异，就P53基因突变而言，某一肿瘤病人的肿瘤细胞P53基因突变，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞P53基因都发生突变，因此利用某一肿瘤机制而增殖的病毒不足以杀灭所有肿瘤细胞。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化、混入正常细胞以及坏死区域也可能限制病毒扩散。再次，某此肿瘤的病毒受体(如柯萨奇病毒受体)表达不充分限制病毒对其感染。第四，病人的免疫反应限制病毒增殖和播散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用Elb 55kDa蛋白缺失型病毒(ONYX-015)治疗肿瘤，其临床有效率只有15-20％(Nemunaitis，J.等人，癌症研究(Cancer Res.)，2000，60(22)6359；US 5677178；US 5801029)。本专利技术人创造性地将肿瘤的抗体治疗与肿瘤特异性增殖病毒治疗方法相结合，首次提出了肿瘤的抗体-病毒治疗方法，即采用肿瘤增殖特异性病毒携带治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因，成功实现了在肿瘤细胞内特异性病毒复制和增殖，形成高浓度病毒，直接破坏肿瘤细胞，同时在肿瘤细胞内随病毒复制而实现所携带的治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因大量表达，产生协同作用。本专利技术所述抗体-病毒治疗方法，由于携带治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因的肿瘤增殖特异性病毒在肿瘤组织中特异性复制及增殖，其高效表达肿瘤的抗体或抗体片段是在肿瘤组织内部产生，因此克服了治疗肿瘤的抗体或抗体片段难以进入实体瘤组织的困难；同时携带治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因的肿瘤增殖特异性病毒生产成本低廉，从而解决了治疗肿瘤的抗体或抗体片段大量生产成本高的难题，因而从疗效及经济上均优于肿瘤的抗体治疗法。同时也比单纯采用肿瘤特异性增殖病毒方法进行治疗更为有效。其中该病毒基因组中包含一种编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列，该病毒选自1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；2)病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制之重组病毒；3)包含至少一种增殖必需区蛋白功能缺失且能在肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。本专利技术的另一个目的在于提供一种利用本专利技术的病毒用于治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤1)将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加及治疗肿瘤的抗体或抗体片段表达量增加；由此抑制肿瘤形成、生长及转移。适当地，本专利技术所述方法还包括在本专利技术所述病毒感染肿瘤细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物。本专利技术的又一目的在于提供了一种本专利技术所述的病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。本专利技术提供一类重组病毒，将编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加，从而治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因表达量增加，该病毒选自1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；2)病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制之重组病毒；3)包含至少一种增殖必需区蛋白功能缺失且能在肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。本专利技术中可以选用多种野生型病毒，只要它们在一种或多种肿瘤细胞中可特异性增殖。优选腺病毒、单纯疱疹病毒。本专利技术所述病毒增殖必需区依所采用的病毒不同而不同，但容易为本领域技术人员知晓。本专利技术所述所述“病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制”是指病毒增殖必需基因与肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的在病毒基因组中的相对位置依所用病毒的不同可以是多种多样的，只要该增殖必需基因的转录能够受到肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制。在一个实施方案中，本专利技术所述病毒中包含的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以在病毒增殖必需基因的转录起始位点之前适当的位置。在本专利技术的另一个实施方案中，肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以替代病毒自身的启动子。在本专利技术的另一个实施方案中，本专利技术所述病毒还可以是在病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域包含至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的重组病毒。其中所述顺式作用元件可选自端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子，缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子(E2F启动子)，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。当所用其中所述病毒为腺病毒时，其增殖必需基因为病毒早期基因，该腺病毒增殖必需基因为以下腺病毒的早期表达基因之一E1A、E1B、E2或E4。本专利技术所述的病毒还可以是增殖必需区包含至少一种蛋白功能缺失且能在肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。其中所述蛋白功能缺失可以是通过对编码基因的点突变、删除、插入突变，从而使所述蛋白的功能缺失。在本专利技术的一个实施方案中，所述病毒一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B55Kda基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B55Kda蛋白质功能异常。在本专利技术的一个实施方案中，所述病毒一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B19kDa基因通过点突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于该病毒基因组中包含一种编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列，该病毒选自：１）在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；２）病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制 之重组病毒；３）包含至少一种增殖必需区蛋白功能缺失且能在肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，杨琴，吴孟超，
申请(专利权)人：杨琴，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]