一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法。该方法针对瓜实蝇设计了1组LAMP引物，通过LAMP扩增，能够将瓜实蝇与其近似种进行区分，具有良好的特异性；且反应灵敏度好，能够检测到4.60ng/μL的DNA模板；还能够对快速粗提的DNA作为模板进行扩增。采用本发明专利技术所述方法用肉眼观察反应料液的颜色所得的检测结果与电泳检测、实时荧光检测的结果一致。本发明专利技术所述方法从样本DNA提取开始到得到检测结果，可在100min内完成，大大提高了检测速度；而且所需设备简单，操作简便，适用于口岸一线和没有配备先进分子检测设备的工作条件下使用。

A rapid visualization method for the molecular detection of melons

The present invention discloses a method for rapid visualization of the molecular detection of melon fly. The design method of 1 sets of LAMP primers for b.cucurbitae, amplified by LAMP, the melon fly and the similar species were distinguished, with good specificity and sensitivity; good, able to detect 4.60ng/ L DNA template; also can quickly extract DNA as a template for amplification. The results of this method are consistent with the results of electrophoretic detection and real-time fluorescence detection. The method of the invention is extracted from the sample DNA to get test results, can be completed within 100min, which greatly improves the detection speed; and the required equipment is simple, easy to operate, suitable for use in the front line of the port and not equipped with advanced molecular detection equipment operating conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法
本专利技术涉及瓜实蝇的检测方法，具体涉及一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法。
技术介绍
瓜实蝇Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae(Coquillett)属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae，是一种在热带、亚热带地区广泛分布的重要有害生物，可危害100余种瓜果蔬菜。由于其危害大，且容易随寄主果实调动作远距离传播，从而严重影响果蔬生产和国际贸易，我国和许多国家及地区将其列为重要的进境检疫性有害生物。长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态学的特征而确定的，由于生活环境不同，实蝇形态特征随之发生相应的变化，给鉴定带来困难甚至错误。在瓜果蔬菜的检疫中，常常获得的是实蝇的幼虫和卵，然而依靠现有的技术，实蝇幼虫很难通过形态鉴定到种；如果将幼虫和卵饲养到成虫再进行种类鉴定，这会需要较长的时间，影响到口岸检疫的运行速度和检疫质量，因此迫切需求建立一套快速、准确、切实可行的实蝇检测技术。环介导恒温扩增(LAMP)是由Notommi等在2000年首先建立起来的一种全新的核酸恒温扩增技术。LAMP具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，已受到人们的广泛关注。目前该技术在病毒、细菌、寄生虫鉴定领域取得了令人瞩目的效果，但是在昆虫鉴定领域应用的还很少，目前还未见有将其应用于瓜实蝇鉴定的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，该方法检测速度快，具有良好的特异性，反应灵敏度好。本专利技术所述的快速可视化瓜实蝇分子检测方法，包括以下步骤：1)设计LAMP引物，包括2条内引物和2条外引物，分别如下：F3：5’-AGTAAGTAAGGGTTGATTAAGGT-3’；B3：5’-CCTTACTCCCGATTCTTCAC-3’；FIP：5’-TCCCCTTCCACCCATATTTCTCCTGCAATTATTACAATGAATCCTG-3’；BIP：5’-AGATCCGGTGTTTGATGTAAGAATCCATTTATCGTACTCCAGCAATA-3’；2)提取样本DNA，制备DNA模板；3)配制LAMP反应体系，在反应之前向其中加入羟基萘酚蓝(HNB)，之后进行反应；4)反应结束后，灭酶，之后根据反应料液的颜色判定是否为瓜实蝇。采用本专利技术所述方法检测是否为瓜实蝇时，当步骤4)反应得到的反应料液的颜色呈蓝色时即判定为瓜实蝇。在反应过程中，dNTPs在酶催化下形成DNA链，释放出磷酸盐；磷酸盐与反应体系中的镁离子结合形成沉淀。在反应体系中加入金属指示剂羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝随着反应液中的镁离子浓度的不同，呈现不同颜色；因此，可以通过肉眼观察反应料液的颜色的变化，判定检测结果。上述方法的步骤3)中，当羟基萘酚蓝的加入量按10μL的反应体系加入1.0×10-6-1.5×10-6mmol的羟基萘酚蓝为基准计算，更优选是按10μL的反应体系加入1.2×10-6mmol的羟基萘酚蓝为基准计算。上述方法的步骤3)中，通常是控制反应时间≤90min，为了降低出现假阳性的机率，优选是控制反应时间60-85min；进一步控制反应时间为70-80min，更优选控制反应时间为70-80min，从而有效控制假阳性出现的机率。上述方法的步骤2)中，DNA样本和模板DNA采用现有常规试剂盒及方法进行提取，优选的，采用QuickExtractDNAExtractionSolution试剂盒(epicentre公司)提取样本DNA，具体的方法参照试剂盒的说明书。上述方法的步骤3)中，所述LAMP反应体系包括缓冲液、酶液、Mg2+、dNTPs、DNA模板或样本DNA、水和步骤1)中的LAMP引物，可以采用现有常规方法进行配制。LAMP体系的终体积及其中各物质的浓度可参考现有技术，在本申请中，具体如下：各引物：F3/B3各0.2μmol/L,FIP/BIP各1.6μmol/L；DNA模板：200-20ng；镁离子：5-8mmol/L(终浓度)；甜菜碱：0.4-0.6mol/L；反应体系的终体积优选为10-25μL。上述方法的步骤3)中，反应通常在60-66℃条件下进行，优选是在63-65℃条件下进行，更优选在65℃条件下进行。灭酶即使酶失活，操作与现有技术相同，具体可以是将反应完成后的料液升温到98-100℃使酶失活。与现有技术相比，本专利技术的特点在于：1、通过设计特殊的LAMP引物、在反应之前加入羟基萘酚蓝，并结合其它步骤，实现通过肉眼观察反应料液的颜色来判定检测结果；2、反应无需像PCR反应在多重温度下反复升降温，检测在100min(包括样本DAN的提取)内即可完成，检测速度快；3、设计的LAMP引物使得本专利技术所述方法具有良好的特异性，反应灵敏度好，能够检测到4.60ng/μL的DNA模板。4、本专利技术所述方法具有高度的准确性，经试验，与电泳法和实时荧光检测法的结果一致；5、本专利技术所述方法简单易操作，所需设备简单，适用于口岸一线和没有配备先进分子检测设备的工作条件下使用。附图说明图1-3分别为采用实时荧光法、凝胶电泳法及本专利技术所述方法检测各供试昆虫具体所属种类时所得实时荧光扩增图、凝胶电泳图及可视化结果图，其中：M，Marker；ck，H2O；1-3，瓜实蝇B.cucurbitae；2-6，南亚果实蝇B.tau；7，桔小实蝇B.dorsalis；8，桔小实蝇复合种B.dorsalisspeciescomplex；9，近黑颜实蝇B.parater；10，锈实蝇B.rubiginus；11，具条实蝇B.scutellata；12，颜带实蝇B.cilifer；13-15，番石榴实蝇B.correcta；图4-6分别为采用实时荧光法、凝胶电泳法及本专利技术所述方法检测各供试昆虫种类的灵敏度的实时荧光扩增图、凝胶电泳图及可视化结果图，其中：M，Marker；ck，H2O；1-3，瓜实蝇B.cucurbitae；2-6，南亚果实蝇B.tau；7，桔小实蝇B.dorsalis；8，桔小实蝇复合种B.dorsalisspeciescomplex；9，近黑颜实蝇B.parater；10，锈实蝇B.rubiginus；11，具条实蝇B.scutellata；12，颜带实蝇B.cilifer；13，番石榴实蝇B.correcta；1-13供试昆虫的模板浓度分别对应表3中1-13的模板浓度；图7-9分别为采用实时荧光法、凝胶电泳法及本专利技术所述方法检测各供试昆虫种类的实时荧光扩增图、凝胶电泳图及可视化结果图，其中：M，Marker；ck，H2O；1，阳性对照(瓜实蝇)；2，快速提取的样本DNA(稀释2倍)；3，快速提取的样本DNA(稀释3倍)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详述,以更好地理解本专利技术的内容,但本专利技术并不限于以下实施例。实施例11、材料与方法1.1供试昆虫本试验以实蝇监测诱捕的实蝇和口岸截获的实蝇为研究对象，如下述表1所示。所有供试昆虫均经过成虫形态鉴定(幼虫同批截获虫源饲养为成虫后鉴定)和DNA条形码鉴定。表1供试昆虫1.2DNA提取1.2.1基因组DNA常规提取使用DNeasyBlood&Tissue试剂盒(QIAGEN公司)，参考试剂盒说明操作提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，包括以下步骤：1)设计LAMP引物，包括2条内引物和2条外引物，分别如下：F3：5’‑AGTAAGTAAGGGTTGATTAAGGT‑3’；B3：5’‑CCTTACTCCCGATTCTTCAC‑3’；FIP：5’‑TCCCCTTCCACCCATATTTCTCCTGCAATTATTACAATGAATCCTG‑3’；BIP：5’‑AGATCCGGTGTTTGATGTAAGAATCCATTTATCGTACTCCAGCAATA‑3’；2)提取样本DNA，制备DNA模板；3)配制LAMP反应体系，在反应之前向其中加入羟基萘酚蓝，之后进行反应；4)反应结束后，灭酶，之后根据反应料液的颜色判定是否为瓜实蝇。

【技术特征摘要】
1.一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，包括以下步骤：1)设计LAMP引物，包括2条内引物和2条外引物，分别如下：F3：5’-AGTAAGTAAGGGTTGATTAAGGT-3’；B3：5’-CCTTACTCCCGATTCTTCAC-3’；FIP：5’-TCCCCTTCCACCCATATTTCTCCTGCAATTATTACAATGAATCCTG-3’；BIP：5’-AGATCCGGTGTTTGATGTAAGAATCCATTTATCGTACTCCAGCAATA-3’；2)提取样本DNA，制备DNA模板；3)配制LAMP反应体系，在反应之前向其中加入羟基萘酚蓝，之后进行反应；4)反应结束后，灭酶，之后根据反应料液的颜色判定是否为瓜实蝇。2.根据权利要求1所述的快速可视化瓜实蝇分子检测方法，其特征在于：步骤4)中，当反应料液的颜色呈蓝色时即判定为瓜实蝇。3.根据权利要求1所述的快速可视化瓜实蝇分子检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述羟基萘酚蓝的加入量按10μL的反应体系加入1.0×10-6-1.5×10-6mmol为基准计算。4.根据权利要求1所述的快速可视化瓜实蝇...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟勇，黄素萍，李羕然，马福欢，梁琨，蓝翊文，何成伟，
申请(专利权)人：凭祥出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：广西,45