一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒。所述方法包括如下步骤：S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，S2、检测培养上清液中HBV pgRNA浓度，S3、根据培养上清液中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。所述试剂盒中含有上游引物、下游引物和荧光标记探针以及逆转录引物，其序列分别为序列表序列1—4序列。本发明专利技术具有检测灵敏度高、敏感，检测过程简便、周期短的优点。

A method and kit for detecting and evaluating the activity of anti HBV drugs

The present invention relates to a method and a kit for detecting and evaluating the activity of anti HBV drug. The method comprises the following steps: S1, added to the culture system of animal cells or human hepatocellular carcinoma cells in anti HBV drugs to be tested were cultured in HBV pgRNA concentration in the supernatant of S2, detection of culture, S3, according to the concentration of pgRNA in supernatant of HBV test anti HBV drug activity results. The kit contains upstream primers, downstream primers and fluorescent labeling probes, and reverse transcriptase primers. The sequence of the kits is sequence 1 - 4 sequence, respectively. The invention has the advantages of high sensitivity, sensitivity, simple detection process and short period.

【技术实现步骤摘要】
一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒。
技术介绍
乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病毒HBV属于嗜肝DNA病毒科，正嗜肝DNA病毒属，基因组长约3.2kb，是一种部分双链环状DNA。在HBV感染者的血液中，电镜下可以同时观察到三种不同的病毒颗粒：包括直径为42nm的大球形颗粒，为完整的病毒颗粒，具有传染性，也称为Dane颗粒；还可以见到直径22nm的小球形颗粒和管形颗粒。小球形颗粒和管形颗粒为乙型肝炎表面抗原，没有核酸，无传染性。乙型肝炎病毒HBV外面有一层包膜，上面有乙肝表面抗原，包膜里面是病毒的核心颗粒，其内为乙肝的核酸和聚合酶。HBV的核酸为部分双链的DNA，又称为环状松弛DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)，其基因组编码HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶和HBx蛋白。HBV含4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即：前S/S区、前C/C区、P区和X区。HBV编码四种不同长度的mRNA，分别长3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb。根据HBV全基因序列差异≥8％或S区基因序列差异≥4％，HBV可分为不同的基因型，各基因型又可分为不同亚型。目前，HBV至少有9个基因型(A～I)，我国以B型和C型为主。HBV基因型与疾病进展和干扰素治疗应答有关，与C基因型感染者相比，B基因型感染者较少进展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HBeAg阳性患者对干扰素治疗的应答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型。当乙型肝炎病毒HBV进入人体后，有感染性的HBV病毒颗粒顺着人体的血液循环不停的前进。乙型肝炎病毒HBV属于嗜肝DNA病毒，对肝脏细胞具有特异性的感染力。因此，当HBV顺着血液循环到达肝脏时，HBV便会进入肝脏细胞。近来研究发现，肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸-协同转运蛋白(NTCP)是HBV感染所需的细胞受体。首先，HBV特异性的与肝脏细胞上的NTCP受体结合从而吸附到肝脏细胞上，脱掉最外面的包膜，HBV病毒的核心颗粒核衣壳或者称作衣壳体进入肝脏细胞的包浆之中。之后核心颗粒在包浆中释放出其内的HBVDNA，即rcDNA，rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状DNA(covalentltclosedcircularDNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA(pregenomicRNA，pgRNA)和其它mRNA，pgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA。一方面，rcDNA与相关mRNA表达的蛋白组装形成HBV病毒颗粒，覆盖包膜后释放进入血液中；另一方面，rcDNA会重新进入细胞核内，形成新的cccDNA。这就形成了一个“cccDNA池”，由于“cccDNA池”的存在就使得细胞一直处于被感染状态。对于慢性乙型肝炎患者，现在公认的最基础的治疗是抗病毒治疗，包括干扰素(IFN)和核苷(酸)类似物(NA)。干扰素包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素，也可称为短效干扰素和长效干扰素；核苷(酸)类似物现在国内批准的药物有5种，分别是拉米夫定(简称M或LAM)、阿德福韦(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF)。M等核苷(酸)类似物的主要的作用位点为HBV的逆转录酶。文献：一种检测和评价抗病毒感染活性的方法(CN103468826B)，利用沉降性病毒复合物技术，建立了一种检测和评估分子抗病毒能力的新方法。该方法是通过检测受试分子在血清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力，检测分子的抗病毒和抗感染能力；所述的病原体是病毒。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充，该方法的建立为目前还没有有效的细胞和动物感染模型病毒的药物研发，提供了一种新的选择。该专利技术还涉及抗病毒感染活性的检测试剂、检测过程中出现的沉降性病原体复合物和上述检测方法的应用。文献：稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法(CN103266133B)公开了稳定表达拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒的细胞株的构建方法，通过细胞分子生物学技术使HBV全基因整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞基因组中，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。该专利技术所构建的细胞株能够支持HBVDNA的高水平复制及抗原的稳定表达，对拉米夫定具有高度耐药性，适用于HBV生物学特性、耐药机理及新型抗病毒药物的体外筛选研究。现有技术筛选抗HBV药物相对比较复杂，检测手段有病历组织切片染色法、电镜法、免疫检测法、DNA检测法等，上述方法各有优点，在不同时间段以不同方式检测药物治疗乙肝的情况，同时也检测肝脏的变化，特别是HBVDNA的检测，从分子水平去监控疾病的治疗程度，但是其检测灵敏度不能完全满足临床需求，甚至不能更精准的检测是否可以停药以及判断治疗进展情况。因此，为了克服上述技术缺陷，提供一种检测和评价抗HBV病毒药物活性的方法是十分必要的。现有的抗HBV药物，如M等，主要的作用机制是抑制HBV的逆转录酶，对肝细胞中的cccDNA作用微乎其微。逆转录的模板为HBVpgRNA，在HBVDNA病毒载量很低的情况下，HBVpgRNA会代偿性的升高，这是造成患者停药后很快复发的关键因素。因此，血清中pgRNA的含量可能是一个更好的评价患者病情的指标。国外有相关文献证明，在HBVDNA很低的情况下，确实存在pgRNA仍会处于比较高的状态的情况。我们通过HBVpgRNA定量的高低，来判断抗HBV药物的敏感性。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种非治疗非诊断目的的检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒，可以在不同药物作用下，检测HBVpgRNA变化，用来判断药物治疗HBV的效果，或者筛选出较好的抗HBV药物，突破目前HBVDNA检测结果不够准确全面的缺陷。本专利技术利用HBVpgRNA的特点，创造性地采用了一步法定量pgRNA并为寻找治疗乙肝病毒有效的药物提供更为敏感的筛选方法。该过程简便，周期短，很好地克服了现有技术的缺陷。为达到以上目的，本专利技术提供了一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，S2、检测培养上清液中HBVpgRNA浓度，S3、根据培养上清液中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。本专利技术还提供了一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的转HBV基因动物的离体血清进行HBVpgRNA浓度测定，根据离体血清中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。本专利技术还提供了一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的乙肝患者的离体血清进行HBVpgRNA浓度测定，根据离体血清中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。在上述任一所述检测和评价抗HBV药物活性的方法中，所述判断待测抗HBV药物活性结果的标准为：当培养上清液或离体血清中HBVpgRNA浓度在500本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，S2、检测培养上清液中HBV pgRNA浓度，S3、根据培养上清液中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。

【技术特征摘要】
1.一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，S2、检测培养上清液中HBVpgRNA浓度，S3、根据培养上清液中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。2.一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的转HBV基因动物的离体血清进行HBVpgRNA浓度测定，根据离体血清中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。3.一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的乙肝患者的离体血清进行HBVpgRNA浓度测定，根据离体血清中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。4.如权利要求1—3中任一所述的方法，其特征在于：所述判断待测抗HBV药物活性结果的标准为：当培养上清液或离体血清中HBVpgRNA浓度在500copies/mL以下时，所述待测抗HBV药物的活性或敏感性较好，当培养上清液或离体血清中HBVpgRNA浓度在1.0×105copies/mL以上时，所述待测抗HBV药物的活性或敏感性较差，当培养上清液或离体血清中HBV...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈广磊，刘明坤，叶锋，
申请(专利权)人：北京旌准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11