细长聚球藻PCC 7942的基因表达调控系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供一种细长聚球藻PCC 7942的基因表达调控系统，包含细长聚球藻PCC 7942细胞、基因表达干扰单元和基因编辑单元。本发明专利技术另提供一种调控细长聚球藻PCC 7942基因表达的方法，包含提供细长聚球藻PCC7942细胞、利用基因编辑单元将外源基因嵌入细长聚球藻PCC 7942细胞中和利用基因表达干扰单元抑制目标基因的表达。藉此，可全面性地操控细长聚球藻PCC 7942的代谢路径，优化目标产物的产量。

Synechococcus elongatus PCC 7942 gene expression system and its application

【技术实现步骤摘要】
细长聚球藻PCC7942的基因表达调控系统及其应用
本专利技术涉及一种蓝绿菌的基因表达调控系统及应用，特别是蓝绿菌基因编辑的方法、抑制蓝绿菌基因表达的方法及调控蓝绿菌基因表达的方法。
技术介绍
随着气候变迁以及能源危机的驱动下，已有许多生质能利用微生物结合基因工程大规模的被生产出来。蓝绿菌生活的栖息地相当广泛，具有高多样性能适应于高盐类浓度、温差变化大或者是高浓度二氧化碳的环境。且蓝绿菌能进行光合作用将二氧化碳转换成可用的生质能，相较于其他异养的生物，蓝绿菌不需提供额外的碳水化合物来当作碳源。仅需提供阳光、二氧化碳、水、氮、磷以及微量的矿物质等简单的生活需求，被认为近年来最具有潜力的微生物之一。新一代基因工程的目标已从利用微生物表达单一蛋白发展至从基因层次全面性地操控微生物的代谢路径，使其能够分解或生产特定物质。因此，同时针对基因组上多个位置进行基因嵌入/基因剔除，或调控基因表达成为基因工程研究上非常重要的课题。目前被广泛应用的基因剪辑系统包含源于噬菌体，发展成熟且常应用于大肠杆菌的同源重组系统(homologousrecombinationsystem)，以及近年来兴起的类转录活化因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases；TALENs)。然而，源自噬菌体的同源重组系统在染色体嵌入外源基因时有其长度限制，无法嵌入大于3.5kb的DNA片段。而TALENs则牵涉到酶的设计与更动，执行上较为繁复、耗时。此外，若欲使用质粒作为载体来生产目标蛋白，质粒的不稳定性及其对抗生素的需求会影响基因表达的稳定性，并增加生产成本。目前已能利用代谢工程技术获得高产量生质能的微生物，但若要更有效率的使微生物制造生质能，了解微生物染色体中各个基因，并抑制与目标产物竞争的代谢路径，来优化其表达为重要目标之一，其中包含使用基因剔除(knockout)及基因减弱(knockdown)两种方式。目前在蓝绿菌当中若要使目标基因无法表达，来达到抑制其他与目标产物竞争的代谢路径，传统上是利用同源重组的方法来剔除目标基因，进而调控代谢路径。但由于蓝绿菌为多倍体生物，利用传统方法不能明确且有效剔除目标基因。此外，若要剔除多个目标基因时，需结合FLP/Frt或Cre/loxp等重组酶系统(BerlaBM,etal.2013.Syntheticbiologyofcyanobacteria:uniquechallengesandopportunities.FrontMicrobiol4:246.)，执行上较为繁复且需花较长时间筛选，还会留下剩余的FLP或Cre序列，当下次再使用同样的重组酶系统时，可能会造成不必要的基因移除。因此，即使是生长速度最快的蓝绿菌，若要完全剔除单一个目标基因也需花大约3周的时间，且还会受限于无法调控目标基因以及无法剔除会对细胞有负面影响的必要基因等问题。
技术实现思路
本专利技术的一方面是提供一种细长聚球藻(Synechococcuselongates)PCC7942基因编辑系统，包含细长聚球藻PCC7942细胞、CRISPR/Cas9表达质粒和模板质粒。CRISPR/Cas9表达质粒包含tracrRNA、Cas9基因的序列及crRNA。模板质粒包含依序排列的同源互换左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互换右臂，其中同源互换左臂和同源互换右臂构成同源互换区，且同源互换区的序列与细长聚球藻PCC7942的染色体的第一特定序列相对应，crRNA序列对应细长聚球藻PCC7942的染色体的第二特定序列。依据前述的细长聚球藻PCC7942基因编辑系统，其中同源互换区可为NSI(neutralsiteI)序列。依据前述的细长聚球藻PCC7942基因编辑系统，其中同源互换左臂的长度和同源互换右臂的长度相同，可为400bp至700bp。依据前述的细长聚球藻PCC7942基因编辑系统，其中抵抗抗生素基因可为抵抗卡纳霉素(kanamycinresistance,KmR)基因、抵抗氯霉素(chloramphenicolresistance,CmR)基因或抵抗观霉素(Spectinnomycinresistance,SpecR)基因。本专利技术的另一方面是在提供一种细长聚球藻PCC7942基因编辑的方法，包含下述步骤：先构建CRISPR/Cas9表达质粒和模板质粒，构建的CRISPR/Cas9表达质粒包含tracrRNA、Cas9基因的序列及crRNA。构建模板质粒包含依序排列的同源互换左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互换右臂，其中同源互换左臂和同源互换右臂构成同源互换区，且同源互换区的序列与细长聚球藻PCC7942的染色体的第一特定序列相对应，crRNA序列对应细长聚球藻PCC7942的染色体的第二特定序列。将CRISPR/Cas9表达质粒和该模板质粒共转化至细长聚球藻PCC7942细胞中，以得到转化株。再培养转化株，其中CRISPR/Cas9表达质粒表达的tracrRNA、Cas9蛋白和crRNA会形成Cas9蛋白复合体，对转化株的染色体的第二特定序列进行双股断裂，且模板质粒的同源互换区与转化株的染色体的同源互换区会进行同源交换，将抵抗抗生素基因和外源基因嵌入转化株的染色体的同源互换区中。依据前述的细长聚球藻PCC7942基因编辑的方法，还包含筛选步骤，是以含有抗生素的培养基培养转化株进行筛选，其中抗生素可为卡纳霉素(kanamycin)、氯霉素(chloramphenicol)或观霉素(Spectinnomycin)。依据前述的细长聚球藻PCC7942基因编辑的方法，其中同源互换区为NSI基因。藉此，本专利技术的细长聚球藻PCC7942的基因编辑系统及细长聚球藻PCC7942基因编辑的方法，透过将外源基因同源重组嵌入细菌染色体中，可克服以质粒生产的短处，并可加速将外源基因同时嵌入细长聚球藻PCC7942的4套染色体的程序，且所得的同源重组体的外源基因表达稳定。而利用本专利技术的细长聚球藻PCC7942的基因编辑系统及细长聚球藻PCC7942基因编辑的方法，可编辑细长聚球藻PCC7942的代谢网络，使其成为产出琥珀酸的菌株。本专利技术的又一方面是在提供一种细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，包含细长聚球藻PCC7942细胞、dCas9表达质粒和sgRNA质粒。dCas9表达质粒包含依序排列的第一同源互换左臂、第一启动子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互换右臂，其中第一同源互换左臂和第一同源互换右臂构成第一同源互换区。sgRNA质粒包含依序排列的第二同源互换左臂、第二启动子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互换右臂序列，其中第二同源互换左臂和第二同源互换右臂构成第二同源互换区，sgRNA上spacer的序列与目标基因的序列相对应，所述目标基因位于细长聚球藻PCC7942细胞的染色体或外源质粒上，第二同源互换区和第一同源互换区不相同，且抵抗第二抗生素基因和抵抗第一抗生素基因不相同。依据前述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中第一同源互换区可为NSI(neutralsiteI)基因或NSII(neutralsiteII)基因。依据前述的细长聚球藻PCC794本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细长聚球藻(Synechococcus elongates)PCC 7942的基因编辑系统，其特征在于包含：细长聚球藻PCC 7942细胞；CRISPR/Cas9表达质粒，其中该CRISPR/Cas9表达质粒包含tracrRNA、Cas9基因及crRNA；以及模板质粒，其中该模板质粒包含依序排列的同源互换左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互换右臂，该同源互换左臂和该同源互换右臂构成同源互换区，且该同源互换区的序列与该细长聚球藻PCC 7942的染色体的第一特定序列相对应，该crRNA序列与该细长聚球藻PCC 7942的该染色体的第二特定序列相对应。

【技术特征摘要】
1.一种细长聚球藻(Synechococcuselongates)PCC7942的基因编辑系统，其特征在于包含：细长聚球藻PCC7942细胞；CRISPR/Cas9表达质粒，其中该CRISPR/Cas9表达质粒包含tracrRNA、Cas9基因及crRNA；以及模板质粒，其中该模板质粒包含依序排列的同源互换左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互换右臂，该同源互换左臂和该同源互换右臂构成同源互换区，且该同源互换区的序列与该细长聚球藻PCC7942的染色体的第一特定序列相对应，该crRNA序列与该细长聚球藻PCC7942的该染色体的第二特定序列相对应。2.根据权利要求1所述的细长聚球藻PCC7942的基因编辑系统，其中该同源互换区为NSI(neutralsiteI)序列。3.根据权利要求1所述的细长聚球藻PCC7942的基因编辑系统，其中该同源互换左臂的长度和该同源互换右臂的长度相同，且为400bp至700bp。4.根据权利要求1所述的细长聚球藻PCC7942的基因编辑系统，其中该抵抗抗生素基因为抵抗观霉素(SpecR)基因、抵抗卡纳霉素(KmR)基因或抵抗氯霉素(CmR)基因。5.一种细长聚球藻(S.elongates)PCC7942的基因编辑方法，其特征在于包含：构建CRISPR/Cas9表达质粒，其中该CRISPR/Cas9表达质粒包含tracrRNA、Cas9基因及crRNA；构建模板质粒，其中该模板质粒包含依序排列的同源互换左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互换右臂，该同源互换左臂和该同源互换右臂构成同源互换区，且该同源互换区的序列与该细长聚球藻PCC7942的染色体的第一特定序列相对应，该crRNA的序列与该细长聚球藻PCC7942的该染色体的第二特定序列相对应；将该CRISPR/Cas9表达质粒和该模板质粒共转化至细长聚球藻PCC7942细胞中，以得到转化株；以及培养该转化株，其中该CRISPR/Cas9表达质粒表达的该tracrRNA、一Cas9蛋白和该crRNA形成Cas9蛋白复合体，对转化株的染色体的该第二特定序列进行双股断裂，且该模板质粒的该同源互换区与该转化株的该染色体的该同源互换区进行同源交换，将该抵抗抗生素基因和该外源基因嵌入该转化株的该染色体的该同源互换区中。6.根据权利要求5所述的细长聚球藻PCC7942的基因编辑方法，其中还包含筛选步骤，是以含有抗生素的培养基培养该转化株。7.根据权利要求6所述的细长聚球藻PCC7942的基因编辑方法，其中该抗生素为观霉素、卡纳霉素或氯霉素。8.根据权利要求5所述的细长聚球藻PCC7942的基因编辑方法，其中该同源互换区为NSI(neutralsiteI)序列。9.一种细长聚球藻(S.elongates)PCC7942的基因表达干扰系统，其特征在于包含：细长聚球藻PCC7942细胞；dCas9表达质粒，其中该dCas9表达质粒包含依序排列的第一同源互换左臂、第一启动子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互换右臂，该第一同源互换左臂和该第一同源互换右臂构成第一同源互换区；以及sgRNA质粒，其中该sgRNA质粒包含依序排列的第二同源互换左臂、第二启动子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互换右臂序列，该第二同源互换左臂和该第二同源互换右臂构成第二同源互换区，该sgRNA上的序列与目标基因的序列相对应，其中该目标基因位于该细长聚球藻PCC7942细胞的该染色体或外源质粒上，该第二同源互换区和该第一同源互换区不相同，且该抵抗第二抗生素基因和该抵抗第一抗生素基因不相同。10.根据权利要求9所述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中该第一同源互换区为NSI(neutralsiteI)序列或NSII(neutralsiteII)序列。11.根据权利要求9所述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中该第二同源互换区为NSI(neutralsiteI)序列或NSII(neutralsiteII)序列。12.根据权利要求9所述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中该抵抗第一抗生素基因为抵抗卡纳霉素(KmR)基因、抵抗氯霉素(CmR)基因或抵抗观霉素(SpecR)基因。13.根据权利要求9所述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中该抵抗第二抗生素基因为抵抗卡纳霉素基因、抵抗氯霉素基因或抵抗观霉素基因。14.根据权利要求9所述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中该第一启动子为Smt启动子、LtetO1启动子、ConII-ribo启动子、LlacO1启动子、BAD启动子、Trc启动子、Trc’启动子、LlacO1’启动子、ConII启动子、J23101启动子或J23119启动子。15.根据权利要求9所述的细长聚球藻PCC7942的基因表达干扰系统，其中该第二启动子为Smt启动子、LtetO1启动子、ConII-ribo启动子、LlacO1启动子、BAD启动子、Trc启动子、Trc’启动子、LlacO1’启动子、ConII启动子、J23101启动子或J23119启动子。16.一种抑制细长聚球藻(S.elongates)PCC7942基因表达的方法，其特征在于包含：构建dCas9表达质粒，其中该dCas9表达质粒包含依序排列的第一同源互换左臂、第一启动子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互换右臂，该第一同源互换左臂和该第一同源互换右臂构成第一同源互换区；构建sgRNA质粒，其中该sgRNA质粒包含依序排列的第二同源互换左臂、第二启动子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互换右臂，该第二同源互换左臂和该第二同源互换右臂构成第二同源互换区，该sgRNA上的序列与目标基因的序列相对应，其中该目标基因位于该细长聚球藻PCC7942细胞的该染色体或外源质粒上，该第二同源互换区和该第一同源互换区不相同，且该抵抗第二抗生素基因和该抵抗第一抗生素基因不相同；将该dCas9表达质粒转化至细长聚球藻PCC7942细胞中，以得到第一转化株，其中该dCas9表达质粒的该第一同源互换区与该第一转化株的染色体的该第一同源互换区进行同源交换，将该第一启动子、该dCas9基因的序列及该抵抗第一抗生素基因嵌入该第一转化株的该染色体的该第一同源互换区中；将该sgRNA质粒转化至该第一转化株中，以得到第二转化株，其中该sgRNA表达质粒的该第二同源互换区与该第二转化株的该染色体的该第二同源互换区进行同源交换，将该第二启动子、该sgRNA及该抵抗第二抗生素基因嵌入该第二型株的该染色体的该第二同源互换区中；以及培养该第二转化株，并加入诱导物诱导该dCas9表达质粒表达dCas9蛋白，该dCas9蛋白与该sgRNA质粒表达的该sgRNA形...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡育诚，李泓，黄俊纮，宋立瑜，沈志哲，
申请(专利权)人：胡育诚，长春人造树脂厂股份有限公司，长春石油化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71