使用生长素前体有效产生转基因植物制造技术

一种产生转基因植物的方法，它包括：（Ａ）将载体引入植物细胞，其中所述载体是用来将基因引入植物的，它包含：所需基因、含有编码酶的基因的可选标记基因，这种酶可由生长素前体合成生长素；（Ｂ）在生长素前体和／或其类似物存在时培养已通过上述载体引入所述基因的植物细胞，由此可制得再分化组织，检测并选择该再分化组织；以及（Ｃ）培养将上述在（Ｂ）中选出的再分化组织以成再分化一种植物个体，和一种将基因引入植物的载体，所述载体包含：所需基因以及含有吲哚乙酰胺水解酶（ｉａａＨ）基因和异戊烯转移酶（ｉｐｔ）基因，但没有色氨酸单加氧酶（ｉａａＭ）基因的可选标记基因。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用基因工程技术有效产生转基因植物的方法，以及用于此方法的载体。(2)技术背景当通过将所需基因引入感兴趣的植物来产生转基因植物时，通常需要以下三个步骤(1)将所需基因引入植物细胞；(2)选择植物组织(已引入所需基因的组织)，所述组织含有已引入所需基因的细胞，以及(3)使植物由所选植物组织再分化。这些步骤中，在选择已引入所需基因的组织时，仅仅将所需基因的表达作为细胞培养阶段的指标不容易选择这种组织，因此将所需基因和可选标记基因一起引入植物细胞，这种可选标记基因的表达容易检测，并可根据存在或不存在可选标记基因的表达选择所述已引入所需基因的组织。所用可选标记基因实际上且通常包括与药物抗性有关的基因，如卡那霉素抗性基因(NPTII新霉素磷酸转移酶基因)和潮霉素抗性基因(HPT潮霉素磷酸转移酶基因)，它们可提供对抗生素的抗性，以及磺酰脲抗性基因(ALS乙酰乳酸合酶基因)，它可提供对农药的抗性，等等。当将与药物抗性有关的基因用作可选标记基因时，在引入基因后用含有此类药物的培养基培养细胞，这种药物可评定所述可选标记基因存在或不存在(即药物抗性)，并将评定结果作为指标进行选择。由于这种药物对植物细胞通常是有毒的，当用这种培养基培养时，未引入可选标记基因(故而也未引入所需基因)的植物细胞会死亡。然而，即便在这种情况下存在抗性，即即使植物细胞在这种药物存在时可以生长，这也是程度的问题，因此在这种药物存在时进行培养对植物细胞有不可避免的坏影响，这实际上造成了诸如生长率减少和伴随植物细胞活性降低产生的已引入所需基因的组织再分化率减少之类的问题。为解决这些问题，在JP-A-9-154580中介绍了一种将基因引入植物的新型载体和用所述载体将基因引入植物的方法。当用上述载体和方法引入基因时，仅将基因引入后植物组织的形态学变化作为指标就可选出已引入所需基因的组织，而无需使用会降低植物细胞活性的药物。在上述JP-A-9-154580揭示的载体和方法中，诱导形态学异常的基因，如植物激素合成基因被用作可选标记基因，在基因引入后，可以不定芽或不定根的形式由组织获得已引入所需基因的组织。然而，在用这种方式获得的不定芽或不定根中，存在相当大量的未引入所需基因的组织(以后也称为“逃逸组织(escape)”)。似乎细胞(已和所需基因一起引入了诱导形态学异常的基因)产生的植物激素等被转移到其周围的细胞中，因此造成了上述影响，同时，由受到影响的未引入基因的细胞分化和增殖的组织也显示出形态学异常。通常认为将基因引入植物是困难的，且不定芽最初在植物中有很低的再分化率。此外，由于存在这种逃逸组织，对已引入所需基因的组织的选择效率非常低，因此特别需要改进再分化率和选择效率。(3)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供有效产生转基因植物的方法，它可选择已引入所需基因的组织而无需使用会降低植物细胞活性的药物，此外，它还有改进的选择效率。本专利技术的另一个目的是提供用于此方法的载体。本专利技术的这些目的和其它目的是通过产生转基因植物的方法实现的，所述方法包括(A)将载体引入植物细胞，其中所述载体是用来将基因引入植物的，它包含所需基因，以及含有编码酶的基因的可选标记基因，这种酶可由生长素前体合成生长素；(B)在生长素前体和/或其类似物存在时培养已通过上述载体引入所述基因的植物细胞，由此可制得再分化组织，检测并选择该再分化组织；以及(C)将上述在(B)中选出的再分化组织培养成再分化的植物个体。同时，本专利技术的这些目的和其它目的也可通过用来将基因引入植物的载体实现，所述载体包含所需基因，以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和异戊烯转移酶(ipt)基因，但没有色氨酸单加氧酶(iaaM)基因的可选标记基因。(4)附图说明图1是显示pIAH6载体中将被整合到植物染色体的T-DNA区域的结构的示意图。图2是显示pIPT10载体中将被整合到植物染色体的T-DNA区域的结构的示意图。(5)具体实施方式作为深入研究的结果，本专利技术人发现通过人工控制在已引入所需基因的细胞中合成生长素的量可实现上述目的，因此完成了本专利技术。在本专利技术所述的方法(以后也可称为“本专利技术的方法”)中，生长素前体-生长素合成基因被用作可选标记基因。生长素是一种植物激素，已知它促进细胞伸长、增殖和分裂。例如，就植物病原体根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，此后称为“A.tumefaciens”)而言，通过色氨酸单加氧酶的氧化，色氨酸被转化成生长素前体吲哚乙酰胺(IAM)，然后IAM被吲哚乙酰胺水解酶水解，由此转变成天然的生长素吲哚乙酸(IAA)。在这种情况中，编码色氨酸单加氧酶的基因是iaaM基因，编码吲哚乙酰胺水解的基因是iaaH基因(D.Inze，M.VanMontagu，Mol.Gen.Genet.，194265(1984))。当iaaH基因单独存在时不能合成生长素(Harry Klee，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42529-51(1991))。通过分析iaaH基因清楚得知，它在此过程中是作为生长素前体-生长素合成基因的，因此，那些精通此领域的技术人员将容易得到这种基因，且它是优选用于本专利技术的基因。同样，除了生长素前体-生长素合成基因，其它植物激素合成基因(如上述iaaM基因)和作为植物激素的细胞因子合成基因(它可促进侧芽增殖和细胞分裂)也可用作可选标记基因。特别地，当使用细胞因子合成基因时，仅通过调节培养基中生长素前体和/或其类似物的浓度就有可能控制植物细胞(已通过本专利技术的方法引入所需基因)产生再分化组织。最典型的作为细胞因子合成基因的基因是ipt基因(A.C.Smigocki，L.D.Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855131(1988))。由于也已经清楚分析了ipt基因，那些精通此领域的技术人员将容易得到这种基因，且它是优选用于本专利技术的基因。根据本专利技术的方法，含有这些作为植物激素基因的可选标记基因和所需基因一起被插入载体(已知是作为将基因引入植物的载体)并被引入植物细胞。可间接通过病毒或感染植物的细菌，或者直接通过物理和化学技术将所述载体引入植物细胞(I.Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42205(1991))。当通过病毒或感染植物的细菌引入载体时，例如，可以使用花椰菜花叶病毒、双粒病毒组、烟草花叶病毒和雀麦花叶病毒等病毒和根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根土壤杆菌(Agrobaterium rhizogenes)等细菌。此外，通过物理和化学技术引入所述载体的方法包括微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、融合法、高速弹道穿透法等。引入基因后，在生长素前体和/或其类似物存在的情况下培养该植物细胞，以产生不定芽之类的再分化组织。在这种情况下，生长素前体或其类似物是可通过表达作为可选标记基因引入的生长素前体-生长素合成基因转变成生长素的物质，或是可通过表达作为可选标记基因引入的生长素前体-生长素合成基因而具有类似于生长素的生理活性的物质(以后也可称为“生长素样物质”)。例如，当上述iaaH基因被表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括：（Ａ）将载体引入植物细胞，其中所述载体是用来将基因引入植物的，它包含：所需基因，以及含有编码酶的基因的可选标记基因，这种酶可由生长素前体合成生长素；（Ｂ）在生长素前体和 ／或其类似物存在时培养已通过上述载体引入所述基因的植物细胞，由此可制得再分化组织，检测并选择该再分化组织；以及（Ｃ）培养上述在（Ｂ）中选出的再分化组织以再分化一种植物个体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：松永悦子，杉田耕一，海老沼宏安，
申请(专利权)人：日本制纸株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]