一种高密度异养培养转基因小球藻来生产兔防御素的方法，其特征在于，该方法包括： ａ）．在生物反应器中加入ｐＨ为５．０～７．０的培养基，所述培养基由ＫＮＯ↓［３］０．５～３克／升、酵母粉３～１１克／升、葡萄糖５～３０克／升以及少量无机盐、微量元素和水组成，按工作体积的５～１５％接入转兔防御素基因小球藻种培养，培养温度为２５～３０℃，ｐＨ小于８．５，控制溶氧在２０％以上，至转基因小球藻细胞密度最高时结束培养； ｂ）．从步骤ａ）所得培养物中纯化得到兔防御素。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种。
技术介绍
人们对小球藻的研究历史较长，但把小球藻作为新型表达系统来研究仅是近年来才开展的工作。到目前为止，有关外源基因在小球藻中能稳定表达的报道不多。中科院遗传与发育生物学研究所孙勇如等将兔防御素NP-1基因导入小球藻，使该基因作为一种组成型蛋白得到了稳定的表达(孙勇如，付荣昭，曹光诚，等。防御素基因的植物表达载体质粒。中国专利.C12N15/63，1126760，1996-07-17；孙勇如，陈颖，马江生，等。转基因小球藻的高效生物反应器。中国专利.C12N15/79，1203277，1998-12-30)。这是外源蛋白在小球藻中成功表达的首例报道。防御素在临床上具有重要的潜在应用价值，但迄今尚无有效的制备方法。兔防御素(NP-1)是防御素中抗菌谱最广的一种。转NP-1基因小球藻有望成为防御素制备的有效方法。鉴于NP-1的潜在应用价值和小球藻的实用价值，转NP-1基因小球藻在海水育苗、海水养殖、饲料添加剂、保健品及食品添加剂等行业具有广阔的应用前景；此外，小球藻作为一种新型的表达系统具有诱人的应用前景。鉴于转NP-1基因小球藻的潜在应用，高密度大规模培养是该转基因小球藻成功迈向实际应用的关键技术之一。中科院遗传与发育生物学研究所孙勇如等采用Knop混合营养培养基在摇瓶中混合营养培养转NP-1基因小球藻，但培养效率不高，最高细胞密度仅为1.5g/L左右，无法获得足够量的的转基因小球藻细胞以开展转基因小球藻的应用研究。微藻培养的营养模式有三种光自养培养、混合营养培养和异养培养。异养培养是实现微藻高密度培养的有效方法。目前文献中报道的转基因微藻的培养大多采用光自养培养，这种培养方式存在细胞密度底、培养过程难以放大等缺点。迄今，异养培养转基因微藻未见文献报道。因此有必要开展转基因小球藻高密度培养研究。实现转基因小球藻高密度培养可从三个方面着手一是确定最佳的营养模式，二是选择合适的培养基，三是建立合适的培养工艺。申请人的另一项专利技术专利已给出了适合异养培养转NP-1基因小球藻的培养基，因此有必要对转NP-1基因小球藻的最佳营养模式和培养工艺进行进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决如何使转NP-1基因小球藻在保持单位细胞NP-1表达量不变的情况下其细胞密度有显著地提高。为了实现上述目的，本专利技术者确认转NP-1基因小球藻的最适营养模式为异养，并进一步提供了一种，该方法包括a).在生物反应器中加入pH为5.0～7.0的培养基，所述培养基由KNO30.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升以及少量无机盐、微量元素和水组成，按工作体积的5～15％接入转兔防御素基因小球藻种培养，培养温度为25～30℃，pH小于8.5，控制溶氧在20％以上，至转基因小球藻细胞密度最高时结束培养；b).从步骤a)所得培养物中纯化得到兔防御素。本专利技术建立的高密度培养工艺，适合于NP-1基因在小球藻中稳定表达。用本专利技术方法异养培养转NP-1基因小球藻，每升细胞密度可达17～40g/L，在NP-1表达量变化不大的情况下，大大提高藻体的培养密度可大大提高兔防御素的产量，从而为该转基因藻的成功应用奠定了基础。此外，本专利技术方法操作方便，适合于工业化生产。附图说明图1为实施例1中营养模式的实验结果示意图。图中-△-表示光自养培养的细胞密度；-□-表示异养培养的细胞密度；-■-表示混合营养培养的细胞密度。图2为实施例2中确定最适硝酸钾浓度的实验结果示意图。图中，△表示0.1g/L▲为0.5g/L；◇为0.9g/L；●为1.3g/L；○为1.7g/L；□为2.1g/L；■为对照。图3为实施例2中确定最适硝酸钾补加浓度的实验结果示意图。图中-●-表示培养过程中补加硝酸钾(硝酸钾浓度维持在0.9g/L)的细胞密度；-○-培养过程中不补加硝酸钾的细胞密度；-■-培养过程中补加硝酸钾(硝酸钾浓度维持在0.9g/L)的NP-1表达量；-□-培养过程中不补加硝酸钾的NP-1表达量。图4为实施例3中确定最适葡萄糖补加浓度的实验结果示意图。图中实线为利用Haldane模型拟合的曲线，散点为实测值。图5为实施例4中5L生物反应器的实验结果示意图。图中-■-采用本专利技术的异养培养工艺的细胞密度，27.8g/L；-●-采用本专利技术的异养培养工艺的NP-1表达量。图6为实施例5中15L生物反应器的实验结果示意图。图中-■-采用本专利技术的异养培养工艺的细胞密度，34.2g/L；-●-采用本专利技术的异养培养工艺的NP-1表达量。具体实施方案本专利技术涉及一种，该方法包括a).在生物反应器中加入pH为5.0～7.0的培养基，所述培养基由KNO3 0.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升以及少量无机盐、微量元素和水组成，按工作体积的5～15％接入转兔防御素基因小球藻种培养，培养温度为25～30℃，pH小于8.5，控制溶氧在20％以上，至转基因小球藻细胞密度最高时结束培养；b).从步骤a)所得培养物中纯化得到兔防御素。在本专利技术所用的培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对转基因小球藻的细胞密度有很大影响。例如，作为无机氮源的KNO3的围为0.5～3克/升，作为有机氮源的酵母粉可在3～11克/升之间，作为碳源的葡萄糖可在5～30克/升之间，因此这些组分的用量不应受实施例的限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还应加入少量无机盐，例如硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。在本专利技术中，较佳的微量元素组分宜选自H3BO5、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、(NH4)6MoO24·4H2O、CuSO4·5H2O。在一个具体方案中，所述培养基基本上由以下成分组成KNO30.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升、KH2PO40.1～0.3克/升、Ca(NO3)20.15～0.45克/升、MgSO4·7H2O 0.01～0.1克/升、KCl 0.05～0.15克/升、FeCl30.005～0.03克/升；微量元素0.5～3ml，其中微量元素的组成为H3BO40.061克/升、ZnSO4·7H2O 0.287克/升、MnSO4·H2O 0.169克/升、(NH4)6MoO24·4H2O0.01235克/升、CuSO4·5H2O 0.00249克/升；水。在一个更佳的方案中，所述培养基的组成为葡萄糖15g/L，KNO30.9g/L，酵母粉9g/L，KH2PO40.13g/L，Ca(NO3)20.2g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，KCl 0.06g/L，FeCl30.01g/L，H3BO40.061mg/L，ZnSO4·7H2O 0.287mg/L，MnSO4·H2O 0.169mg/L，(NH4)6MoO24·4H2O 0.01235mg/L，CuSO4·5H2O 0.00249mg/L。在根据上述配方配制成培养基组合物后，可将所述培养基的pH为5.0～7.0，并在115-120℃下高压灭菌15～20分钟。在将上述培养基加入生物反应器中后，加水(宜是自来水)至工作体积的60～80％后灭菌。然后，当温度本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李元广，韩兴梅，王伟，沈国敏，魏晓东，魏鸿刚，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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