甜菜黑色焦枯病毒作为外源基因的表达载体制造技术

一种分离出的ｃＤＮＡ分子，其特征在于，它包括与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １中从核苷酸１－３６４１同源性高达７０％的核苷酸序列。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因工程中使用的载体。具体的讲，是一种来源于病毒的可以携带外源基因在植物中表达的载体。2.
技术介绍
上世纪80年代以来，在我国新疆、宁夏、内蒙古、甘肃、黑龙江、吉林等甜菜主产区陆续发现了一种黑色焦枯型甜菜病毒病害，给生产带来了巨大的损失。该病害在甜菜上的症状主要表现为叶片直立向上，叶脉间产生黑色焦枯病斑，叶缘内卷，根毛大量坏死等，对甜菜的危害已超过甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV)，并且日趋加重。1989年，仅宁夏发病面积便约占全区甜菜产区69.2％，其中，绝产或丧失使用价值的占4.6％。专利技术人经过10多年的研究，在国际上首次证明引起该病的病原微生物为一种新的病毒，并定名为甜菜黑色焦枯病毒(Beet blackscorch virus，BBSV)，同时还对BBSV的生物学、血清学、粒子形态及其传播方式等进行了深入全面的研究，获得了一系列的研究结果。现已证明，BBSV是一种直径为28nm的球型病毒，外壳蛋白亚基为单一组分，分子量约为24.5kDa。自然条件下只侵染甜菜，人工机械接种条件下可侵染4科13种植物，如苋色藜、番杏和本生烟等。BBSV由甘蓝油壶菌(Olpidium brassicae)以游动孢子鞭毛体外带毒方式携带传播，血清学上只与烟草坏死病毒(Tobacco necrotic virus，TNV)柳树分离物具有较弱的血清学关系。甜菜黑色焦枯病毒是一种仅在我国发现的新病毒，在世界其他国家或地区还没有关于该病害的类似报道。中国是唯一开展对BBSV研究的国家，但目前对于该病毒的研究只局限于病毒的生物学、形态学和血清学等基础生物学的研究。本专利技术首次描述了BBSV基因组的核苷酸序列和结构特征，确认了基因组上不同基因的功能，在此基础上进一步对病毒基因组加以改造，使之成为能够携带外源基因并能在植物中高效表达的病毒载体。3.
技术实现思路
1.测定了BBSV这种新病毒的全基因组核苷酸序列(SFQ ID NO 1)，确定了BBSV基因组的大小和结构。序列分析表明，BBSV基因组为一条单链正意ss(+)RNA，由3641个核苷酸组成，包含6个开放阅读框(ORFs)。位于RNA 5’末端的ORF编码一个22kDa的蛋白P22，该蛋白的琥珀终止密码子通读(Reading-through，R/T)后可产生82kDa的通读蛋白P82，为病毒的依赖RNA的RNA聚合酶。在BBSV RNA 3’末端的ORF编码一个24.5kDa的外壳蛋白(CP)。在聚合酶基因和外壳蛋白基因之间有三个小的ORFs，分别编码4.2kDa蛋白P4.2和两个7kDa蛋白P7a和P7b(见图1)。经GenBank检索比较，BBSV虽然与烟草坏死病毒的D株系(TNV-D)的同源性最高，序列一致性程度也仅为61％。根据BBSV生物学和血清学表现、真菌传播特性、基因组的大小和结构，核苷酸序列同源性，以及在个别分离物中存在的卫星RNA组分等研究结果，专利技术人将BBSV定名为烟草坏死病毒属的一种新病毒。2.构建了T7启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52，它含有SEQ ID NO 1核苷酸序列和T7启动子，BBSV基因组在T7启动子控制下能够得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。3.构建了CaMV 35S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pRBS2，它含有SEQ IDNO 1核苷酸序列和CaMV 35S启动子，通过35启动子的作用，可以使BBSV的cDNA在植物体内得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。4.利用已获得的BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52和pRBS2，对病毒基因组的不同区域进行突变改造，确认了BBSV基因组不同基因的作用，并对它们的功能区域进行了定位。5.在对BBSV基因组功能基因进行精确定位的基础上，对BBSV基因组的不同区域进行缺失突变或者替换突变，在保证病毒的侵染能力和自身的复制能力并不受到明显影响的前提下，减弱病毒的致病能力，在此基础上构建出能够携带外源基因的病毒表达载体。6.感染、转化寄主植物，测定了利用BBSV作为外源基因表达载体的效果。将BBSV这一种目前仅在我国发现的新病毒，改造成为具有能够携带外源基因、便于操作、感染效率极高等特点的病毒载体，用于利用植物生产药用蛋白质，在材料上具有独创性。4.附图说明图1.BBSV基因组的结构与编码蛋白的大小图2.BBSV全长cDNA的PCR扩增结果A为λDNA/EcoR I+Hind III双酶切Marker；B为BBSV 3.64kb的全长cDNA的PCR扩增产物图3T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录产物A为pUBF52的体外转录物B为BBSV RNA图4T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆体外转录物侵染活性的Northern blot检测，其中g为BBSV基因组；sg1为亚基因组1；sg2为亚基因组2A为T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录物接种B为空白对照C为以BBSV RNA接种图5T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆体外转录物侵染活性的Western blot检测A为空白对照B为以BBSV RNA接种C为以T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录物接种图635S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆侵染活性的Northern blot检测1为空白对照2为T7启动子控制下BBSV全长侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录物接种3为以BBSV RNA接种4和5为35S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pUBS2接种图7BBSV基因组4种缺失突变体(pBDCP、pDCPn100、pDCPc6和pDCP18)结构示意8BBSV基因组不同缺失突变体体外转录物侵染活性的Northern blot检测A空白对照B接种物为BBSV的RNAC接种物为BBSV全长cDNA克隆体外转录物D-G接种物分别为BBSV外壳蛋白基因缺失突变体(pBDCP、pDCPn100、pDCPc6和pDCP18)的体外转录物图9用激光共聚焦显微镜(Confocal)观察水母绿色荧光蛋白(GFP)基因在BBSV病毒载体中的表达，绿色为表达的水母绿色荧光蛋白A为pUBF52(含BBSV全长cDNA，未插入GFP基因)体外转录物接种的苋色藜叶片B为pUB-GFP(由T7启动子控制)体外转录物接种的苋色藜叶片C为pRBS-GFP(由35S启动子控制)接种的苋色藜叶片5.具体实施方式实施例1BBSV全基因组cDNA的克隆与序列分析从宁夏、新疆、内蒙古、甘肃、黑龙江、吉林等甜菜主产区表现黑色焦枯症状的甜菜上分离病毒，磨擦接种苋色藜(Chenopodium amaranticolor)和番杏(Tetragonia expansa)等寄主植物，采用PEG沉淀和差速离心等常规方法从苋色藜病叶中提取病毒，再经苯酚-氯仿抽提，获得BBSV的RNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果，BBSV核酸为ssRNA，大小约为3.6-3.7kb，经Oligo(dT)纤维素柱洗脱实验证明，BBSV RNA的3′末端无Poly(A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于嘉林，蔡祝南，李大伟，韩成贵，刘仪，曹云鹤，原雪峰，丁群，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：