来源于多形汉逊酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）表达的重组ＳＡＲＳ病毒Ｓ、Ｓ１、Ｓ１－１、Ｓ１－２、Ｓ１－３、Ｓ２、Ｓ２－１、Ｓ２－２、Ｓ２－３、Ｓ２－４、Ｓ２－５基因，对上述基因的核苷酸序列进行修饰延长或缩短形成的具有功能类似的基因，其核苷酸序列分别与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１１所示的相对应的核苷酸序列具有至少７５％的同源性。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质表达基因工程领域，具体地讲是涉及利用SARS病毒重组S、S1、S2和主要抗原表位基因和利用含有这些基因的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)作为细胞工厂进行高效表达以及利用其表达产物在用于研制预防SARS病毒的疫苗中的应用。专利技术人利用DNAStar、VectorNTI等软件及其附带的在线分析工具，对美国、加拿大、香港、北京、广州等地的SARS病毒分离株从核苷酸序列到蛋白结构进行了预测和分析。发现目前所有SARS病毒分离株Spike蛋白的差异仅纯在S1上，S2高度保守，而且目前所有SARS病毒分离株蛋白的差异仅纯在S1上，S2高度保守，而且目前所有SARS病毒分离株的S2基因全部一致。S基因全长3768bp，编码1255个氨基酸(AA)。其中1-16AA为信号肽，66-609AA为S1蛋白区，641-1247AA为S2蛋白区。在S2蛋白中，潜在的糖基化位点主要集中在787-1221AA区域，非常类似副粘病毒的融合蛋白(Fusion)。在S2蛋白的1148-1236AA位置，存在一个特殊的Coiled coil结构(1149-1188AA)和亮氨酸拉链(1148-1182AA)及富含Cys的结构(1217-1236AA)，专利技术人推测该区域可能在SARS病毒与宿主细胞融合时起着非常关键的作用。为此，专利技术人根据汉逊酵母高表达基因密码子用法表(专利申请号03110441.X)设计了一系列不同长度的S基因，以在汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中高效表达，根据这些基因片段产生的抗体对SARS病毒的阻断效果，确定非典型性肺炎治疗性和预防性疫苗研制的最佳方案。本专利技术是基于这样一种发现而完成的。因此，本专利技术的目的在于提供一种重组SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因和利用含有该基因的多形汉逊酵母作为细胞工厂进行高效表达，以及利用这些表达产物在制备SARS病毒基因工程疫苗中的应用。本专利技术的多形汉逊酵母重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO1-11所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO12-22所示的氨基酸序列。为达，本专利技术的技术路线是利用多形汉逊酵母高表达基因密码子用法表(如附图说明图1所示，中国专利申请号03110441.X)。根据Genbank上报道的SARS病毒编码的S基因(登录号AY278554，CUHK-W1株)的核苷酸序列(如图2所示，全长3768bp)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO12所示(全长1255氨基酸)。根据Vector NTI 8.0软件及其附带的SMART(SimpleModular Architecture Research Tool)等在线程序进行结构域组成、蛋白二级结构、跨膜螺旋、糖基化位点、抗原表位分析。根据分析结果，专利技术人将SARS病毒S基因的编码蛋白分成S(1-1255AA)、S1(17-640AA)、S1-1(66-609AA)、S1-2(17-232AA)、S1-3(258-572AA)、S2(641-1247AA)、S2-1(641-856AA)、S2-2(883-1197AA)、S2-3(1149-1183AA)、S2-4(1149-1236AA)、S2-5(787-1188AA)共11个区域。按照汉逊酵母高表达基因的密码子用法将S(1-1255AA)、S1(17-640AA)、S1-1(66-609AA)、S1-2(17-232AA)、S1-3(258-572AA)、S2(641-1247AA)、S2-1(641-856AA)、S2-2(883-1197AA)、S2-3(1149-1183AA)、S2-4(1149-1236AA)、S2-5(787-1188AA)区域对应的氨基酸序列转变成核苷酸序列，即得到按照汉逊酵母高表达基因密码子用法设计的编码基因，分别对应于如SEQ IDNO1-11所示的核苷酸序列。这些基因(SEQ ID NO1-11)与SARS病毒相应的编码基因编码的氨基酸同源性为100％，其编码的氨基酸序列分别如(SEQ ID NO12-22)所示，至于核苷酸序列同源性至少在75％。考虑到汉逊酵母高表达基因对个别同义密码子偏好的摆动以及SARS不同分离株在S1基因编码蛋白上的差异，美国、加拿大、香港、北京、广州等地的SARS病毒分离株的S1基因编码的蛋白共有5个氨基酸差异，而S2基因完全一致。因此，优化的编码重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的核苷酸序列，除SEQ IDNO1-11所示的核苷酸序列外，由于核苷酸序列突变的缺失、增加仍产生编码相同功能的蛋白的核苷酸序列，应当指出，这些序列分别对应于上述SEQ ID NO1-11所示的核苷酸序具有至少75％的同源性。以上所述的这些具有至少75％的同源性的核苷酸序列也涉及本专利技术所要达到的目的之一。由本专利技术得到的按照汉逊酵母高表达基因密码子用法设计的SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因，克服了在汉逊酵母表达系统中的不适应性，从而使这些基因在汉逊酵母中高效表达。在汉逊酵母中表达的SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因更安全可靠，与哺乳动物细胞表达产物相比，无潜在的致瘤性。经纯化后可直接在临床上用于预防SARS病毒引起的“非典型性肺炎”，或者与霍乱毒素B亚单位的编码基因(中国专利申请号03110441.X)融合表达，通过粘膜免疫提高疫苗效果。本专利技术的另一个目的在于提供一种利用汉逊酵母高表达基因密码子用法制备SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白的方法，该方法涉及以下步骤1.按照多形汉逊酵母高表达基因的密码子用法(图1)，优化设计SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因；2.通过基因合成仪，人工合成新设计的编码基因；3.利用中国专利(申请号03110441.X)中的多形汉逊酵母表达载体pHMOXZ-A(胞内表达)、pHFMDHZ-A(胞内表达)、pHMOXZα-A(分泌型表达)、pHFMDHZα-A(分泌型表达)或者其它任何能在汉逊酵母中整合表达的真核表达载体，构建含有已优化的SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的重组表达载体；4.多形汉逊酵母重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白的诱导表达；5.表达产物鉴定和生物学活性鉴定. 按照上述方法步骤获得汉逊酵母(Hansenula polymorpha)高效表达含有SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的重组子，制备SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱并生，宋厚辉，李勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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